姜黄素干预通过促进自噬改善氯化锰所致的大鼠神经行为损伤

来丽叶，窦长松，智翠娜，陈 洁，马 雪，赵 鹏，姚碧云

(北京大学公共卫生学院毒理学系，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是最常见的与衰老相关的神经退行性疾病，并可严重损害人体健康,影响人类生活质量且致残率很高。锰污染是PD的环境危险因素之一，长期接触过量的锰会导致进行性、持久性神经损害，其临床表现类似PD，过量锰亦可损害学习记忆能力，引起不可逆转的进行性认知功能减退[1-2]。锰矿开采、钢铁冶炼、电焊等众多行业的职业人群长期接触锰，可发生慢性锰中毒[3]。近年来，随着人类活动增加，环境锰含量超标，导致环境锰污染，人们接触锰的机会日益增加[4]。过量的锰主要蓄积在中枢神经系统的基底神经节苍白球、纹状体和黑质中，导致神经细胞死亡，但锰中毒的分子机制尚不完全清楚[5-6]。本课题组研究表明，锰可引起氧化应激、线粒体损伤、内质网应激未折叠蛋白反应及细胞自噬[7-9]。转录因子EB(transcription factor EB，TFEB)是转录因子MiTF/TFE家族成员[10]。TFEB通过调节下游基因表达发挥作用，参与多种生理过程。TFEB在细胞自噬中发挥重要的调节作用，成为了新的研究热点[11-12]。姜黄素(curcumin，CUR)是从姜科植物中提取的一种多酚类物质，是姜黄中的最有效成分，近年研究证明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基等多方面药理作用，是一种具有广泛应用前景的药物，且具有一定的神经保护效应[13]，因此，本研究利用MnCl2建立锰中毒大鼠模型，并给予姜黄素进行干预，旨在探讨姜黄素对锰所致神经毒性的干预效果及其可能的机制，为锰中毒以及PD的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与主要仪器

大鼠脑切片模具、Morris水迷宫系统(SLY-WMS)购自北京硕林苑科技有限公司，匀浆仪购自美国MP Biomedicals公司，垂直蛋白电泳系统购自北京六一仪器厂，化学发光凝胶成像分析系统(MINI HD9)购自英国UVITEC公司，低温高速离心机购自德国Eppendorf公司，光学显微镜购自日本Olympus公司，MnCl2·4H2O(V900197, ≥ 99%)、姜黄素(货号C1386, ≥ 65%)购自美国 Sigma公司，兔抗大鼠酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、α-突触核蛋白(α-Synuclein，α-Syn)、TFEB、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p-mTOR、Beclin1、P62和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain-3，LC3)单抗购自英国Abcam公司，小鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)单抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠 IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验动物及分组

本研究开始前已经北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会审查批准(LA2018123)。选用SPF级SD(Sprague Dawley)雄性大鼠(8周龄，体质量190～210 g)，共60只，由北京大学医学部实验动物科学部提供[动物使用许可证号：SCXK(京)2016-0010]，按照相关实验动物管理条例饲养于北京大学公共卫生学院实验动物室。实验前饲养1周，以适应环境。动物室和实验室温度为21～25 ℃，自动通风，明暗周期为12 h/12 h，动物自由摄取食水。

实验动物随机分为空白对照组(negative control，NC)、单独姜黄素组(curcumin，CUR)、锰中毒模型组(MnCl2)、MnCl2+CUR1组(100 mg/kg姜黄素干预组)和MnCl2+ CUR2组(300 mg/kg姜黄素干预组)5组，每组12只。MnCl2的染毒方式为腹腔注射(intraperitoneal injection，ip)，剂量为15 mg/kg(Mn2+6.48 mg/kg)；姜黄素的给药方式为灌胃(intragastric administration, ig)，实验动物经腹腔注射染毒后灌胃给予一定剂量的姜黄素溶液，剂量分别为100 及300 mg/kg。(1)NC组：0.9%(质量分数)生理盐水腹腔注射+双蒸水(double distilled water, ddH2O)灌胃；(2)CUR组：0.9%生理盐水腹腔注射+300 mg/kg CUR灌胃；(3)MnCl2组：15 mg/kg MnCl2腹腔注射+ dd H2O灌胃；(4)MnCl2+ CUR1组：15 mg/kg MnCl2腹腔注射+100 mg/kg CUR灌胃；(5)MnCl2+ CUR2组：15 mg/kg MnCl2腹腔注射+ 300 mg/kg CUR灌胃。各组 1次/d，每周连续5 d，间歇2 d，连续4周，每周记录动物体质量，末次给药后观察1周，进行神经行为学观察后处死，用大鼠脑膜具取纹状体[14]。

1.3 实验方法

1.3.1旷场实验(open-field test，OFT) 一个体积为100 cm(长)× 100 cm(宽)× 50 cm(高)的旷场装置放置在隔音的房间内，严格控制室内温度和通风，选用弱光照明。先将实验动物置于实验室房间30 min以适应周围环境。实验时将动物放置于旷场中央，旷场地面被分成若干网格，记录5 min内动物的活动参数，即直立次数、进入中央区次数、中央区运动距离和时间等。动物在中央的活动反映了焦虑程度，即中央活动越多焦虑越少。

1.3.2大鼠转棒实验 试验前1 d，将大鼠置于转棒上以4 r/min的速度适应60 s，直到其在转棒上60 s内不跌落。测试当日，将大鼠置于转棒上，300 s内转速从4 r/min加速到40 r/min。记录大鼠从转棒上跌落的旋转速度和潜伏期，并取3次试验的平均值。

1.3.3Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)实验 Morris水迷宫装置包含圆柱型水池和可移动位置的平台两部分，水池直径1.5 m，高度0.4 m，圆形平台直径10 cm，位于水面下1.5～2.0 cm。实验包括：(1)定位航行实验：将水池分为东北(NE)、西北(NW)、东南(SE)、西南(SW)4个象限，将大鼠随机地头朝池壁，从4个象限轻轻放入水池中，记录大鼠自入水至找到平台四肢爬上平台所需的时间，作为逃避潜伏期，每次试验中每只大鼠最多游泳90 s，若入水后给定时间内大鼠未能找到平台或未能爬上平台，则将时间记录为90 s，引导其找到平台，让其停留30 s，再进行下一次训练。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔15～20 min，连续训练4 d。(2)空间探索实验：最后一次定位航行实验后24 h，撤除平台，将动物从任一随机象限放入水中追踪其运动轨迹60 s，连续测试两次，记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)的游泳时间、游泳距离、进入目标象限的次数，以及穿过原平台位置的次数。

1.3.4电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) 每组取6只大鼠的一侧纹状体进行检测，麻醉后断头处死，在冰上利用大鼠脑膜具迅速取纹状体，将取得的脑纹状体组织准确称量，加入1.5 mL HNO3，冷消化过夜，加入0.5 mL H2O2，进行微波消解，消化至澄清透明的溶液，定容后用DRC-Ⅱ型电感耦合等离子体质谱仪测定。质谱仪工作参数：雾化气流量0.96 L/min，辅助气流量1.80 L/min，等离子体气流量15.0 L/min，驻留时间0～100 ms，样品提升量1 mL/min。扫描方式为单点跳峰。

1.3.5石蜡脑组织切片及HE染色 每组取6只大鼠，麻醉后断头处死，在冰上利用大鼠脑膜具迅速取纹状体，4%(体积分数)多聚甲醛溶液中固定12 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理后，进行石蜡包埋，对脑组织标本进行连续冠状切片，进行HE染色。在显微镜下观察纹状体组织病理形态学改变，并且每张切片随机选择4个视野，计数200个细胞中的嗜酸性细胞数。

1.3.6透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察 每组用2只大鼠的一侧纹状体进行透射电镜观察。采用心脏灌注进行脑组织体内固定，动物麻醉后，仰卧位固定，打开腹腔，穿过横膈，打开胸腔，暴露心脏，先用预冷的0.9%生理盐水250 mL灌注，然后用预冷的4%多聚甲醛(pH 7.4)200 mL缓慢灌注20～30 min，灌注完毕后断头，在冰上利用大鼠脑膜具迅速取纹状体，分切为大约1 mm3组织块，3%(质量分数)戊二醛溶液中(pH 7.4)固定3 h以上；1%(质量分数)锇酸固定1 h；切片厚度为50～70 nm，捞取在200目的铜网上，醋酸铀及枸橼酸铅染色；JEM100CX-Ⅱ透射电镜(日立公司，日本)观察神经细胞超微结构包括线粒体、内质网和细胞核等亚细胞器的变化，照相，记录。

1.3.7免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)实验 石蜡包埋组织的切片60 ℃烘干，经二甲苯浸透脱蜡，梯度乙醇脱水，之后用双蒸水浸透15 min，PBS浸透5 min。将切片用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)进行热抗原修复，然后以 PBS 洗涤3次，每次3 min。3%(质量分数)H2O2，200 μL/片，室温孵育10 min以灭活内源性酶，PBS浸洗3次。滴加10%(体积分数)羊血清，室温封闭液1 h。将一抗稀释到适宜浓度(TH 1∶1 000，α-Syn 1∶500)50 μL/片，阴性对照加等量PBS，室温2 h或4℃过夜孵育。PBS(pH 7.2)浸洗3～5次，滴加二抗50 μL/片，室温孵育30 min。PBS浸洗4～5次，按DAB显色试剂盒说明书配制显色液，室温下显色，5～10 min。蒸馏水洗涤终止显色后，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明2次，中性树胶封片。显微镜下检查，采集图片。使用Image-Pro Plus 图像分析软件对阳性染色区域进行累积光密度值(integral optical density, IOD)分析。

1.3.8免疫印迹实验(Western blotting，WB) 取6只大鼠的另一半脑纹状体进行该实验，按1∶10(质量分数)加入蛋白质裂解液，提取总蛋白质，用BCA法测定蛋白质浓度，-80 ℃冰箱冻存。取等量蛋白质样品(10～30 μg)经8%～12% SDS-PAGE胶电泳分离，转膜，5%(质量分数)脱脂奶粉室温下封闭2 h，TBST缓冲液洗涤后，依次加p-mTOR，mTOR，P62，Beclin1和LC3一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST 洗涤后，加入二抗稀释液(1∶10 000)室温下孵育2 h。ECL化学发光后利用凝胶成像分析系统采集图片，使用Quantity One软件进行蛋白定量分析，以β-actin为内参蛋白，分析各条带积分光密度值，以目的蛋白与内参蛋白的积分光密度值比值表示蛋白表达水平。

1.3.9TUNEL实验 石蜡包埋组织的切片60 ℃烘干，经二甲苯浸透脱蜡，梯度乙醇脱水，之后用双蒸水浸透15 min，PBS(pH 7.2)浸透5 min。滴加Proteinase K工作液(终浓度2 μg/mL)，100 μL/片，室温孵育20 min。PBS浸洗3次，每次5 min。按说明书配制TUNEL检测混合液，滴加50 μL/片，加盖玻片，在暗湿盒中37 ℃避光孵育1 h。PBS浸洗3次，每次5 min。取出玻片，按试剂盒说明书配制converter-POD 液，滴加50 μL/片，37 ℃避光孵育30 min。PBS浸洗3次，5 min/次。按DAB显色试剂盒说明书配制显色液，取出玻片，滴加50～100 μL/片。显微镜下观察到细胞核变成棕色，放入PBS中终止反应。苏木素复染，梯度酒精脱水，自来水返蓝。二甲苯透明2次，中性树胶封片。显微镜下每张切片随机选择4个视野，计数200个细胞中的TUNEL阳性细胞数并采集图片。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况及体质量变化

各组大鼠给予相应的处理，共4周，锰中毒模型组及MnCl2+CUR1组大鼠从第3周开始出现反应淡漠、皮毛干枯、发黄、少动等行为改变。每周测量各组大鼠体质量变化(表1)。第2～4周，锰中毒模型组大鼠体质量均显著低于空白对照组(P<0.05)，第4周时，MnCl2+CUR1组大鼠体质量亦显著低于空白对照组(P<0.05)，其他各组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 CUR干预对MnCl2 染毒大鼠体质量的影响

2.2 各组大鼠脑纹状体中锰含量

ICP-MS检测各组大鼠脑纹状体中锰含量(表2)，与空白对照组比较，锰中毒模型组、MnCl2+CUR1及MnCl2+CUR2组大鼠脑纹状体中锰含量均显著升高(P<0.05)，而单独CUR组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，表明姜黄素干预并未影响锰中毒大鼠纹状体中锰水平。

表2 CUR干预对MnCl2染毒大鼠纹状体Mn2+含量的影响

2.3 姜黄素干预改善锰中毒大鼠的神经行为

旷场实验和转棒实验测定各组大鼠的焦虑、抑郁状况及运动平衡能力(表3)，与空白对照组比较，锰中毒模型组和MnCl2+CUR1组大鼠的直立次数、进入中央区的次数、中央区运动距离和时间均显著降低(P<0.05)，与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组大鼠的上述指标均显著增加(P<0.05)，而较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。另外，单独CUR组大鼠的上述指标较空白对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。转棒实验结果发现，与空白对照组比较，锰中毒模型组和MnCl2+CUR1组大鼠的在棒时间和在棒圈数显著降低(P<0.05)，与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组大鼠的在棒时间、在棒圈数显著增加(P<0.05)。另外，单独CUR组大鼠的上述指标较空白对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3 CUR干预对MnCl2染毒大鼠神经行为影响

2.4 姜黄素干预改善锰中毒大鼠的学习、记忆能力

利用Morris水迷宫实验检测各组大鼠学习、记忆能力的变化，定位航行实验结果显示(图1)，与第1天相比，随着训练时间的延长，空白对照组及各组大鼠的逃避潜伏期与总航行距离均明显降低(P<0.05)。与空白对照组相比，训练第 3 天和第 4 天，锰中毒模型组和MnCl2+CUR1组大鼠逃避潜伏期显著高于空白对照组(P<0.05)，而MnCl2+CUR2组大鼠与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组大鼠逃避潜伏期显著降低，同时单独CUR组与空白对照组间大鼠逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。

NC, negative control; CUR, curcumin. n=12，*P<0.05, ☆P<0.01, compared with NC group; ★P<0.01，compared with MnCl2 group.

探索实验结果显示(表4)，与空白对照组大鼠相比，锰中毒模型组大鼠穿越平台次数、目标象限游泳时间、目标象限游泳时间百分比(目标象限游泳时间/总时间)、目标象限距离及目标象限距离百分比(目标象限游泳距离/总距离)显著减少(P<0.05)，MnCl2+CUR2组大鼠较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)；而与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组大鼠的上述指标(穿越平台次数、目标象限游泳时间、目标象限游泳时间百分比、目标象限距离及目标象限距离百分比)均显著增加(P<0.05)。

表4 CUR干预对MnCl2染毒大鼠记忆能力的影响

2.5 CUR干预对锰中毒大鼠脑纹状体多巴胺能神经元损伤的影响

TH是多巴胺能神经元标志性蛋白，首先用免疫组化法检测了各组大鼠脑纹状体多巴胺能神经元的定位及TH阳性细胞密度(图2A、2B)，光学显微镜下可见深棕色TH阳性的多巴胺能神经元及其范围。与空白对照组比较，锰中毒模型组和MnCl2+CUR1组大鼠纹状体TH阳性细胞累积光密度值显著减少，与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组大鼠纹状体TH阳性细胞光密度值显著增加(P<0.05)，单独CUR组TH阳性细胞光密度值较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，表明锰中毒大鼠纹状体TH阳性细胞显著减少，而姜黄素干预后可显著增加脑纹状体TH阳性细胞。其次，对各组大鼠脑纹状体进行了HE染色及嗜酸性变细胞分析(图2C、2D)，空白对照组大鼠脑纹状体神经细胞结构清晰，形态正常，呈不规则形状，锰中毒模型和MnCl2+CUR1组大鼠脑纹状体中有较多神经细胞出现嗜酸性变，细胞皱缩、变圆、结构消失、细胞质浓缩，有明显红染甚至形成嗜酸性小体，且嗜酸性变细胞数较空白对照组显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；而MnCl2+CUR2组大鼠纹状体嗜酸性变细胞较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)，与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组大鼠脑纹状体中嗜酸性细胞数显著减少(P<0.05)，另外，单独CUR组大鼠脑纹状体中嗜酸性细胞数较空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

A, DAB staining of TH by ICH(scale bars=1 000 μm)；B, the quantitative results of A; C, the HE staining of coronal section of the striatum(scale bars = 200 μm，the red arrows stood for eosinophilic cells); D, the quantitative results of eosinophilic cells of C.a, negative control(NC); b, curcumin(CUR); c, MnCl2; d, MnCl2+ CUR1; e, MnCl2+ CUR2. ☆P<0.01, compared with NC group; #P<0.05, ★ P<0.01，compared with MnCl2 group.

2.6 姜黄素干预对锰中毒大鼠脑纹状体超微结构改变的影响

透射电镜检测各组大鼠脑纹状体的超微结构(图3)，空白对照及单独CUR组大鼠纹状体神经细胞完整、结构清晰、核染色质松散、核仁清楚，可见较多线粒体、粗面内质网等，结构完整。锰中毒大鼠纹状体神经细胞出现染色质凝结、核固缩、线粒体等细胞器结构尚存，线粒体出现水肿，线粒体嵴断裂、消失形成空泡，可见溶酶体以及自噬泡。MnCl2+CUR2组染色质凝结、核固缩、内质网肿胀、线粒体空泡、水肿等均较锰中毒模型组大鼠明显改善，并可见较多的溶酶体以及自噬泡。

a, negative control(NC); b, curcumin(CUR); c, MnCl2; d, MnCl2+ CUR1; e, MnCl2+ CUR2.Nucleus, yellow arrows, mitochondria, blue arrows; autophagosome, red arrows.

2.7 姜黄素干预对锰中毒聚集性α-Syn表达水平的影响

免疫组织化学及免疫印迹法检测各组大鼠脑纹状体聚集性α-Syn定位及表达水平变化(图4)，空白对照组及单独CUR组大鼠脑纹状体神经元中聚集性α-Syn 表达水平很低，二者差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较，锰中毒模型、MnCl2+CUR1及MnCl2+CUR2组大鼠脑纹状体神经元中其表达水平显著增加(P<0.05)；而与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR1和MnCl2+CUR2组大鼠脑纹状体神经细胞中其表达水则显著降低(P<0.05)。

A, DAB staining of α-Syn by ICH(scale bars = 200 μm); B, the brand of α-Syn by Western blotting；C, the semi-quantitive analysis of density of the protein bands normalized to that of β-actin of B.a, negative control(NC); b, curcumin(CUR); c, MnCl2; d, MnCl2+ CUR1; e, MnCl2+ CUR2. n=6, *P<0.05, ☆P<0.01, compared with NC group; ★P<0.01, compared with MnCl2 group.

2.8 姜黄素干预可促进TFEB核转位

免疫印迹法检测各组大鼠纹状体TFEB在细胞质和细胞核的定位及表达水平见图5，纹状体神经细胞中细胞质TFEB的表达，MnCl2+CUR2组较空白对照组显著降低(P<0.05)，与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组表达水平亦显著降低(P<0.05)。细胞核TFEB表达水平：单独CUR组、锰中毒模型组、MnCl2+CUR1组及MnCl2+CUR2组均较空白对照组显著增加(P<0.05)，与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR1组和MnCl2+CUR2组其表达水平均显著增加(P<0.05)，表明姜黄素干预可以进一步促进锰中毒大鼠纹状体神经元TFEB的核转位。

A, the brand of TFEB by Western blotting；B, the semi-quantitive analysis of density of the protein bands normalized to that of GAPDH/H3 of A.a, negative control(NC); b, curcumin(CUR); c, MnCl2; d, MnCl2+ CUR1; e, MnCl2+ CUR2. n=6.*P<0.05, ☆P<0.01, compared with NC group; # P<0.05, ★P<0.01, compared with MnCl2 group.

2.9 姜黄素干预对锰中毒大鼠脑纹状体自噬相关蛋白表达水平的影响

与空白对照组相比，锰中毒模型、MnCl2+CUR1组及MnCl2+CUR2组大鼠脑纹状mTOR、p-mTOR、P62蛋白表达水平显著降低，Beclin1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达水平显著增加(P<0.05)；与锰中毒模型组相比，MnCl2+CUR1和MnCl2+CUR2组大鼠脑纹状体mTOR、p-mTOR及P62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Beclin1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ表达水平显著增加(P<0.05，图6)。

A, the brands of autophagy-related protein by Western blotting；B, the semi-quantitive analysis of density of the protein bands normalized to that of β-actin of A.a, negative control(NC); b, curcumin(CUR); c, MnCl2; d, MnCl2+ CUR1; e, MnCl2+ CUR2. n=6.*P<0.05, ☆P<0.01, compared with NC group; # P<0.05, ★P<0.01, compared with MnCl2 group.

2.10 姜黄素干预对锰中毒大鼠脑纹状体神经细胞凋亡的影响

用TUNEL染色检测了各组纹状体神经元凋亡(图7)，空白对照组及单独CUR组大鼠脑纹状体细胞轮廓清晰，锰中毒模型组大鼠纹状体神经细胞出现细胞核固缩，形成核染为棕黄色的TUNEL阳性细胞，与空白对照比较，锰中毒模型组及MnCl2+CUR1和MnCl2+CUR2组纹状体TUNEL阳性细胞显著升高(P<0.05)；而与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR1和MnCl2+CUR2组大鼠纹状体TUNEL阳性细胞均显著减少(P<0.05)，表明CUR 干预可减少锰中毒大鼠纹状体神经细胞凋亡。

A, TUNEL staining of rats’ striatum(scale bars = 200 μm); B, the number of TUNEL-positive cells of rats’ striatum.a, negative control(NC); b, curcumin(CUR); c, MnCl2; d, MnCl2+ CUR1; e, MnCl2+ CUR2. = 6，☆P<0.01, compared with NC group; ★P<0.01, compared with MnCl2 group.

3 讨论

锰是神经毒物，过量的锰进入机体可引起神经系统的损害造成锰中毒，早期可表现为抑郁、神经行为改变，学习记忆、认知功能明显减退等，晚期表现为动作迟缓、僵硬、四肢震颤等类帕金森病的症状[1-2]。姜黄素具有消炎、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、神经保护等药理作用[15-18]。有学者报道经口给与一定剂量的姜黄素可以改善大鼠的抑郁行为表现[19-20]，Mansouri等[21]研究发现，腹腔注射给予一定剂量的姜黄素，可以明显改善1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)建立的PD模型小鼠的运动能力。本研究发现，锰中毒模型组及MnCl2+CUR1和MnCl2+CUR2组大鼠纹状体中锰含量均显著增加，表明锰可透过血脑屏障进入纹状体中，姜黄素干预并不能抑制锰的摄入。旷场及转棒实验结果显示，锰中毒模型组大鼠出现自发活动、探索行为减少，中央场活动距离、中央场活动时间以及站立次数减少，转棒实验的在棒时间及在棒圈数显著降低，MnCl2+CUR2组大鼠的上述指标均较锰中毒模型组显著增加(P<0.05)，而与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，表明锰可透过血脑屏障进入纹状体中，锰中毒大鼠可出现焦虑、抑郁、运动及协调能力下降，姜黄素可以改善锰中毒所致抑郁及焦虑表现及运动协调能力。

近年许多文献报道姜黄素可以改善认知及记忆功能[22]，Yi等[16]研究发现经口给与100 mg/kg 姜黄素可显著改善顺铂引起的大鼠认知和记忆功能下降，ELBini-Dhouib等[23]研究发现，姜黄素可以通过抑制抗氧化应激减少炎症，改善AlCl3引起的学习和认知能力降低。Morris水迷宫目前被广泛应用于评价动物的空间学习与记忆能力，本研究定位航行实验的第3、4天训练中，与空白对照组比较，锰中毒模型组及MnCl2+CUR1组大鼠的学习能力及逃避潜伏期均显著降低(P<0.05)；探索实验中，锰中毒模型组及MnCl2+CUR1组大鼠穿越原平台所在位置次数、目标象限中游泳时间较空白对照组均显著下降(P<0.05)，MnCl2+CUR2组大鼠的上述指标均较锰中毒模型组显著增加(P<0.05)，并与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05), 本研究发现锰中毒可引起大鼠学习、记忆能力降低，而一定剂量姜黄素可以明显提高锰中毒所致的学习记忆能力。本课题组前期研究发现，锰可引起纹状体多巴胺能神经细胞损伤，导致细胞变性凋亡[9]。本研究免疫组化和HE染色结果显示，锰中毒模型组TH阳性多巴胺能神经细胞减少，神经细胞嗜酸性变，透射电镜观察发现细胞核固缩凋亡，而姜黄素300 mg/kg干预可显著增加TH阳性多巴胺能神经细胞，减少细胞嗜酸性变，表明姜黄素可显著改善锰所引起的多巴胺能神经细胞的损伤。

α-Syn聚集在PD的发生发展中是一个重要因素，以往研究发现，MnCl2可引起突触核蛋白表达增加并发生聚集[24]。吴忧等[25]利用MPTP建立C57小鼠PD模型，并经腹腔注射给予80 mg/kg 姜黄素，研究发现姜黄素通过增加细胞自噬功能从而促进 α-Syn 的清除，保护保护多巴胺神经元。Singh等[26]利用SH-SY5Y细胞进行的体外研究发现，姜黄素可以调节α-Syn聚集，降低其毒性。本研究显示，锰中毒模型组大鼠脑纹状体中聚集性α-Syn表达水平显著增加(P<0.05)，MnCl2+CUR1和MnCl2+CUR2组中其表达水平较锰中毒模型组显著下降，因此，本研究表明姜黄素可以减少α-Syn聚集。

自噬可以清除细胞中的错误折叠蛋白、聚集蛋白及一些生理或病理条件下衰老受损的细胞器等，以维持细胞结构、代谢和功能的平衡[27]。TFEB是细胞自噬的关键调节因子，通常当细胞营养物质充足时，TFEB被磷酸化保留在细胞质中，而当细胞处于应激条件下，TFEB脱磷酸化进入细胞核内，调节下游自噬相关基因表达如 Beclin1、P62、LC3等[11-12]。本研究发现，细胞质TFEB表达水平，MnCl2+CUR2组较空白对照组显著下降，并且MnCl2+CUR2组较锰中毒模型组显著下降；细胞核TFEB表达水平，各组均较空白对照组显著增加，且MnCl2+CUR1组和MnCl2+CUR2组较锰中毒组亦显著增加，因此表明姜黄素干预可以进一步促进锰中毒大鼠纹状体神经元TFEB的核转位。自噬在神经退行性疾病及多种毒物引起的神经损伤中发挥重要作用。自噬过程涉及多种分子的变化，细胞受到刺激时，作为自噬负调控分子的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白被抑制，p-mTOR降低，传递自噬信号促进自噬体形成。自噬体的形成需要LC3参与，LC3Ⅰ 通过两种类泛素共轭系统形成LC3Ⅱ，定位在自噬体，并且从延伸到溶酶体融合一直处在自噬体膜上[28]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值能反映自噬体的数量[13]。P62能与LC3直接作用，将泛素化的蛋白递送至自噬体，再送至蛋白酶体，从而完成对底物的降解[29-30]。本实验室以往的体内外研究及一些文献发现，一定剂量的锰可以引起自噬, 并且随着锰暴露时间或剂量增加，其可能抑制自噬[7-8, 31]。有研究表明，姜黄素可诱导自噬的功能，在PD动物模型中，姜黄素可通过下调PI3K/Akt/mTOR 信号途径诱导自噬，抑制 Lwey’s小体形成，发挥神经保护作用[32]。本研究通过对自噬相关蛋白表达水平检测发现，与空白对照组比较，锰中毒模型组大鼠脑纹状体中mTOR、p-mTOR、P62蛋白表达水平降低，Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平增加(P<0.05)，与锰中毒组相比，MnCl2+CUR2组大鼠脑纹状体中mTOR、p-mTOR、P62蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平显著增加(P<0.05)。进而，本研究对纹状体神经细胞凋亡的研究结果发现，锰中毒模型及MnCl2+CUR1组纹状体神经细胞凋亡明显，而MnCl2+CUR2组凋亡细胞显著降低；与锰中毒模型组比较，MnCl2+CUR2组细胞凋亡亦明显减少。因此，本研究表明姜黄素可能通过促进TFEB核转位增加锰中毒大鼠脑纹状体细胞自噬而减少细胞凋亡，进而表明姜黄素干预可以降低锰中毒大鼠的神经毒性。

综上所述，一定剂量的姜黄素干预可以减轻锰中毒大鼠纹状体多巴胺能神经元损伤，改善锰中毒大鼠的神经性症状，减少α-Syn 聚集，降低多巴胺能神经元凋亡，其机制可能是通过促进TFEB核转位增强细胞自噬，但尚待进一步研究。