CuInS2/ZnS量子点对人卵颗粒细胞的毒性效应与机制

刘晓宁，耿 蔷，徐江垚，林桂淼，王晓梅，郭遂群

(1．南方医科大学第三附属医院妇产科，广东广州 510600；2．深圳恒生医院生殖医学科，广东 深圳 518100；3．深圳大学医学部国际肿瘤中心，广东 深圳 518055)

量子点(quantum dots，QDs)亦称作半导体纳米晶体，是一种三维尺度均在2~10 nm的半导体纳米荧光颗粒，不仅具有光稳定性好、抗光漂白，具有宽吸收窄发射及高生物相容性[1]等优良特性，而且荧光强度高、特异性强，可用于生物分子的多色标记，亦可实现单分子示踪，其表面还能作相应修饰以获得良好的生物相容性，故在生物学和医学领域具有广泛的应用[2-3]，尤其在单分子标记、靶蛋白示踪等活体成像中更具有应用前景，但其生物安全性尚不清楚，尤其是对人体卵母细胞的影响尚缺少报道，本课题组前期观察量子点对小鼠卵母细胞的毒性效应，发现其主要进入颗粒细胞发挥作用[4-5]。因人卵母细胞的特殊稀缺性与伦理限制而很难直接观察其毒性，颗粒细胞通过细胞质穿过透明带与卵母细胞膜形成缝隙连接，为卵母细胞提供营养。卵母细胞与颗粒细胞的双向信息交流及新陈代谢物质传递主要通过缝隙连接蛋白43和连接蛋白45 进行[6]。缝隙连接的变化可改变卵母细胞成熟状态[7]。本研究采用人超排卵母细胞周围的卵颗粒细胞进行体外原代培养，检测聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰的CuInS2/ZnS 量子点(非镉量子点)对颗粒细胞的毒性效应，间接反映纳米材料对人卵母细胞的毒性效应，为CuInS2/ZnS 量子点在临床应用中的生物安全性评估提供信息。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

CuInS2/ZnS量子点(Najing Tech公司)；透明质酸酶(Sigma 公 司)； TUNEL Assay 试 剂 盒-FITC 荧 光(Colorimetric，Abcam)；Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒(DOJINDO公司)；CCK-8试剂盒及人卵颗粒细胞内的丙二醛(malondialdehyde，MDA)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione， GSH) 与谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)均为国产检测试剂盒；总RNA 提取试剂盒(成都福际生物公司)；Taq Master Mix(Gene Solution 公 司)；SYBR®Green PCR Master Mix(TaKaRa Bio 公司)；GoScript 逆转录试剂盒(Promega)； 雌 二 醇(E2)/孕 酮(P4) 试 剂 盒(Roche Diagnostics公司)。

主要仪器包括：三气培养箱(ASTECAPM50D 公司)；超净工作台(江苏安泰)；单人IVF 工作站(STERILE181ICSIHIMAC 公 司)；离 心 机(Eppendorf 公司)；体视显微镜(日本，SZX10 公司)；实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems 公 司)；流 式 细 胞 仪(BD 公司)；酶标仪(MD公司)。

1.2 体外获取人卵巢颗粒细胞及原代培养

收集2020 年6 月—2020 年8 月在深圳恒生医院生殖中心行体外受精/卵泡浆内单精子显微注射(IVF/ICSI)的不孕症患者13例超排卵，迅速将吸出的卵泡液及冲洗液倒入培养皿中，用吸管吸出可见的卵丘-卵母细胞复合体(oocyte-corona-cumulus complex，OCCs)放入培养液中，示意图见图1A。在培养箱中培养2~4 h后用透明质酸酶消化OCCs，收集颗粒细胞用于实验研究。所有研究对象均自愿参加，本研究获深圳恒生医院伦理委员会批准(伦理批准编号HSYY-SZ-2019-001)及生殖医学伦理委员会批准(生殖伦理批准编号HSYY-SZ-2019-002)通过后采集人体样本，所有患者均已签署知情同意书。

将上述人卵颗粒细胞收集至离心管，加入M199培养基4 mL，并以1 500 r/min离心5 min。用培养基洗涤两次，弃去上清液，添加含20% FBS 的M199 培养基重悬，将其接种在培养皿中，然后置于37 °C、CO2体积分数为5%的培养箱中进行静态培养备用。

1.3 实验分组设计与量子点表征

将颗粒细胞分离并置于单独培养皿中，待细胞贴壁后分组培养：设立PBS 对照组，CuInS2/ZnS 量子点低(1 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)3 个剂量组，培养示意图见图1B。使用动态光散射法测量CuInS2/ZnS 量子点的流体动力学直径和Zeta 电位。图1C显示CuInS2/ZnS量子点的平均流体动力学直径约为14~17 nm。图1D 显示CuInS2/ZnS 量子点的代表性透射电子显微镜图像，CuInS2/ZnS 量子点的Zeta 电位约为-13.52 mV。图1E 显示CuInS2/ZnS 量子点的消光和光致发光光谱，量子点的发射峰约为610 nm。

图1 实验设计示意图与量子点表征

1.4 CCK-8法检测颗粒细胞活力

采用阳性对照药物5-Fu验证颗粒细胞对毒性检测的灵敏性。用透明质酸酶消化志愿者卵母细胞上的颗粒细胞后，将颗粒细胞分离并转移到单独的培养皿中。细胞贴壁后，分别将不同浓度的5-Fu添加到培养基中。在颗粒细胞贴壁后，将5-Fu 设置7 个浓度(0.031 6、0.1、0.316、1、3.16、10 和31.6 μmol/L)梯度加入细胞培养基中，24 h后检查细胞活力计算半数活性抑制浓度(IC50)。随后颗粒细胞体外培养1~6 d，使用CCK-8法动态检测细胞存活变化，确定原代培养颗粒细胞状态，为后续毒性检测确定最佳时间。并检测CuInS2/ZnS 量子点处理48 h 后人卵颗粒细胞的IC50。细胞活力检测按CCK-8 试剂盒说明书进行操作，通过酶标仪测定各实验组在450 nm 处的吸光度值计算细胞活力，每组设3 个平行样，每次实验重复3次。

1.5 TUNEL 法和Annexin V/PI 双染色法分别检测颗粒细胞凋亡

细胞分组培养后，CuInS2/ZnS 量子点处理48 h 检测细胞凋亡情况。TUNEL 法检测中，按照TUNEL Assay-FITC 荧光试剂盒说明书进行操作，检测细胞DNA片段化情况。

Annexin V/PI 双染色法检测：调整细胞浓度为1×107/mL，取100 μL 放入检测管中，加入5 mL PBS 洗涤，1 000 r/min 离心5 min，弃去上清，用孵育缓冲液洗涤1 次，1 000 r/min 离心5 min。弃去上清，向沉淀内加入100 μL Annexin V 标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15 min，沉淀细胞用孵育缓冲液洗1 次，加入PI 溶液室温孵育20 min，避光上机检测。

1.6 实时荧光定量PCR 检测颗粒细胞功能相关基因表达

细胞分组培养后，CuInS2/ZnS 量子点处理48 h 收获颗粒细胞，使用TRIzol 试剂提取总RNA。利用GoScript 逆转录系统(Promega，A5004)对RNA 进行逆转录成cDNA。设计合成颗粒细胞功能相关基因引物(见表1)，采用实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)技术检测如下基因的表达：睾酮合成调节关键蛋白(steroidogenic acute regulatory，StAR)、细胞色P450 侧链裂解酶(cytochrome P450 side chain cleavage enzyme，P450scc)，细胞色P450 芳香化酶(cytochrome P450 aromatase，P450arom)、雌激素受体α(estrogen receptorα，ERα)、雌激素受体β(estrogen receptorβ，ERβ)、 3β-羟 基 类 固 醇 脱 氢 酶(3βhydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)、17β羟化类固醇脱氢酶(17 β hydroxylated steroid dehydrogenase17β-HSD)、 黄 体 生 成 素 受 体(luteinizing hormone receptor，LHR)、卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor，FSHR)。在ABI 7500 DNA 实 时荧光定量PCR 仪进行检测：95 ℃变性5 min 后30 个PCR 循环：95 ℃、1 min，58 ℃、1 min，72 ℃、1 min。随后在SYBR Green PCR Mix 中进行定量，按2-ΔΔCT计算相对表达量。

表1 颗粒细胞功能相关基因引物序列信息

1.7 颗粒细胞分泌雌二醇与孕酮的检测

各组细胞在量子点处理48 h 后收集细胞培养液，所有标本收集后于-80 ℃分装冻存。送医院检验科采用电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)法检测细胞上清液中雌二醇(E2)以及孕酮(P)含量。

1.8 颗粒细胞氧化应激状态检测

分组培养颗粒细胞并接种于6 孔板内，24 h 后更换含有终浓度分别为1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS的培养基，继续培养24 h 后，颗粒细胞用PBS 洗涤3次，用预冷的裂解液裂解后，于4 ℃下1 000 r/min离心15 min，保留上清液用于测定MDA、T-AOC、TSOD、GSH 与GSH-PX 的活性。分别按照试剂盒操作步骤测定，检测结果依照说明书进行计算。

1.9 统计学分析

使用SPSS 22.0 统计软件包进行统计分析。所有数据均用xˉ±s表示，两组之间的差异通过两个独立样本t检验进行分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 5-Fu验证体外原代培养颗粒细胞的毒性敏感性

实验结果表明，与PBS对照组相比，5-Fu可明显抑制颗粒细胞活性(P＜0.01)。1 μmol/L 时5-Fu 对细胞活性的抑制率为(40.35±3.89)%，10 μmol/L 时活性抑制率为(85.30±4.32)%，呈现剂量-效应关系(r=0.958，P＜0.05)。5-Fu 抑 制颗 粒细 胞 生 长 的IC50值 为1.227 μmol/L(图2A)。同时我们对0.5、1、2 μmol/L 5-Fu处理的颗粒细胞进行细胞凋亡分析，流式细胞术检测结果表明，5-Fu处理后的颗粒细胞呈现明显早期凋亡特征(图2B 和C)。5-Fu 诱导的细胞凋亡率在10 μmol/L时是1 μmol/L 的2.37±1.84 倍，显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

图2 5-Fu验证体外原代培养颗粒细胞的毒性效应

2.2 CuInS2/ZnS 量子点对颗粒细胞活力和凋亡率的影响

在颗粒细胞贴壁后，分别将1、10、100 μg/mL CuInS2/ZnS量子点添加到细胞培养基中。从第1天到第6 天，每天动态检查细胞活力。实验结果表明，颗粒细胞在第3 天开始出现自发凋亡(颗粒细胞出现黄素化，图3A)。后续实验均在体外培养48 h 颗粒细胞功能良好状态下进行毒性检测。不同剂量CuInS2/ZnS 量子点作用48 h观后颗粒细胞存活率呈现剂量依赖性下降(r=0.9631，P＜0.05)，CuInS2/ZnS 量子点对颗粒细胞的IC50值为66.72 μg/mL(图3B)。对CuInS2/ZnS 量子点处理的颗粒细胞采用TUNEL和Annexin V/PI双染色法流式细胞仪分别进行凋亡检测：TUNEL凋亡测试的结果表明，CuInS2/ZnS 量子点处理后，颗粒细胞中出现明显的DNA 片段化，并随着剂量增加呈现增加趋势(图3C和D)。流式细胞仪检测结果亦表明，CuInS2/ZnS量子点处理后的颗粒细胞呈现显著细胞早期凋亡特征(图3E和F)。

图3 CuInS2/ZnS量子点对颗粒细胞活力和凋亡的影响

2.3 CuInS2/ZnS 量子点诱导颗粒细胞雌激素与孕激素释放

排卵后颗粒细胞生物功能为分泌孕酮(P)和雌二醇(E2)，它们在生殖系统中起着非常重要的作用。CuInS2/ZnS 量子点处理后，在颗粒细胞培养基中检测到E2和P，表明其生理功能正常。实验结果显示100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子点处理后颗粒细胞大量释放内源性E2和P 与PBS 对照组比较，E2 和P 显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.01，图4A 和B)，且明显上调FSH 受体、17β羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)、3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)、细胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA转录水平(图4C)。

图4 CuInS2/ZnS量子点引发颗粒细胞孕雌激素释放并上调相关基因表达

2.4 CuInS2/ZnS量子点诱导颗粒细胞氧化应激状态

结果发现，10 和100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子点显著增加颗粒细胞中的ROS 含量(P＜0.05 或P＜0.01，图5A和B)。与PBS对照组相比，1 μg/mL 量子点实验组的颗粒细胞中氧化应激标志物的活性未发生显著变化，而10 和100 μg/mL 量子点处理后颗粒细胞中的MDA、T-AOC 及T-SOD 活性均显著低于对照组(P＜0.01)，100 μg/mL 量子点的GSH 活性显著高于PBS 对照组(P＜0.01)，GSH-PX明显低于对照组(P＜0.01)。

图5 CuInS2/ZnS量子点处理后细胞中氧化损伤情况

3 讨 论

本实验成功进行了人类卵颗粒细胞的体外原代培养，原代培养的细胞可以保留其分泌雌、孕激素的功能特性，相关研究亦证实其体外培养的可行性[8-10]，并且对不同浓度的5-Fu 具有敏感的毒性检测反应性，呈现明显的剂量-反应关系，结果表明原代培养的颗粒细胞可以检测理化因子的毒性效应，与国外相关报道一致[11-13]。但持续6 d 体外原代培养颗粒细胞发现，颗粒细胞在第3 天出现自发凋亡现象，提示细胞开始黄素化，因此，毒性检测实验我们控制在体外培养72 h以内开展各项检测。利用此细胞体系，我们观察不同浓度CuInS2/ZnS量子点作用48 h对人卵颗粒细胞的毒性效应并探索其损伤机制。

中、高剂量CuInS2/ZnS 量子点处理后，颗粒细胞中出现明显的DNA片段化，导致细胞凋亡并呈现剂量依赖性。流式细胞术检测结果亦表明，CuInS2/ZnS 量子点诱导细胞早期凋亡发生。已有报道发现非镉量子点对多种细胞具有毒性作用：Chen 等[14]报道InP/ZnS量子点对鲫鱼卵母细胞具有明显毒性，本研究团队课题组报道InP/ZnS 量子点表面不同亚基修饰后对肺癌细胞HCC-15和正常肺泡上皮细胞RLE-6TN均引发明显凋亡，浓度在20~80 μg/mL 范围内的量子点可以引起细胞损伤，增加坏死细胞的数量，显著降低细胞活力，并表现出明显的剂量-效应关系[15]。本实验发现颗粒细胞IC50为66.72 μg/mL，结果与上述报道结果基本一致。

颗粒细胞受损后可以释放内源性激素，本实验结果显示高剂量组量子点明显促进颗粒细胞雌二醇和孕酮的释放，与量子点损伤激活并上调FSH 受体、17β羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)、3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)、细胞色素P450 芳香化酶(P450arom)的mRNA 转录水平密切相关，Du等[12]发现甲基醚通过抑制细胞色素P450芳香化酶功能可以抑制人卵颗粒细胞雌激素生物合成，本实验发现量子点可以激活细胞色素P450芳香化酶功能促进雌激素合成与释放，其可能的分子机制有待后续深入研究。

氧化损伤主要是由ROS产生增加引起的。本研究显示CuInS2/ZnS 量子点处理后，具有促进颗粒细胞产生ROS 的能力，亦有文献报道了InP/ZnS 量子点明显增加肺癌细胞内ROS 含量[13]。当ROS 的产生超过人体的抗氧化能力时，将严重影响细胞的正常功能，并可能导致蛋白质氧化损伤、酶失活、脂质过氧化和DNA链断裂。为了抵消ROS的毒性作用，细胞启动由酶促反应和非酶促反应组成的抗氧化系统进行防御。还原型谷胱甘肽(GSH)是抗氧化系统的重要组成部分，其过度氧化和细胞中总谷胱甘肽浓度的降低可能是导致人体抗氧化能力下降的原因。GSH-PX 具有将体内过量的过氧化物还原为无毒的羟基化合物和H2O，从而降低氧化毒性。MDA是主要的脂质过氧化产物，其含量的变化可用作判断自由基对人体损害程度的标准。本实验发现用量子点处理的人卵颗粒细胞中ROS的产生量显著增加，并表现出剂量依赖性，表明量子点进入细胞后存在氧化应激的产生。CuInS2/ZnS 量子点暴露使MDA 含量显著增加，并且中(10 μg/mL)、高(100 μg/mL)剂量量子点实验组中MDA 含量呈显著增加趋势，表明量子点对人卵颗粒细胞具有明显的自由基损伤作用。暴露于100 μg/mL 量子点会导致人卵颗粒细胞中GSH 含量显著增加，这表明当发生氧化应激时，人卵颗粒细胞会增加GSH 含量并促进其与有毒物质(量子点)的结合以防止自由基损害。SOD、CAT 和GSH-PX 是研究最多的抗氧化酶，其中SOD 主要负责去除超氧阴离子自由基，CAT主要负责过氧化氢的分解，而GSH-PX 主要负责去除H2O2和脂质过氧化物。实验结果表明，高剂量CuInS2/ZnS量子点显著抑制TSOD和CAT的活性，表明量子点诱导人卵颗粒细胞活性氧自由基的增加，CAT降低将引起H2O2堆积，超过T-SOD 和SOD 的清除能力而引起氧化损伤。用100 μg/mL CuInS2/ZnS 量子点处理后，人卵颗粒细胞的GSH-PX 活性明显降低，表明GSH-PX 被抑制在一定程度上可提高过氧化水平，可见，细胞有限的修复能力不能完全解决量子点引起的毒性作用。

综上，本实验成功建立了体外培养的人卵颗粒细胞毒性检测体系，CuInS2/ZnS 量子点可以通过侵入颗粒细胞导致氧化损伤发生细胞凋亡，其毒性的分子机制有待更深入研究。

致谢：感谢深圳恒生医院生殖医学科实验室所有成员收集标本，感谢深圳大学(西丽校区)仪器分析中心提供的帮助。