线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO对氮芥诱导BEAS-2B细胞损伤的影响

赵晨茜，徐安琦，2，艾 多，2，孔德钦，张晓迪，李文丽，海春旭，刘江正，*

（1．空军军医大学军事预防医学系军事毒理学与防化医学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，教育部特殊作业环境危害评估与防治重点实验室，陕西 西安 710032；2．空军军医大学基础医学院学员二大队，陕西 西安 710032)

糜烂性毒剂是一类重要的化学战剂，在历史上曾被大量使用，造成了大量人员伤亡[1]。糜烂性毒剂作为日遗化武的主要成分和重要的化学恐怖剂，对我国人民的安全构成了严重而持久的威胁[2]。肺是糜烂性毒剂中毒的主要靶器官之一，战场条件下大剂量吸入这类毒剂蒸气能够导致急性肺损伤，严重时可导致死亡，目前还缺乏有效的治疗药物[3]。氧化应激、炎症、凋亡和线粒体功能障碍被认为是糜烂性毒剂导致呼吸系统损伤的关键毒作用机制[4]。氮芥(nitrogen mustard，HN2)是经典的糜烂性毒剂之一，也是芥子气的重要模拟剂，主要通过呼吸道和皮肤暴露，吸收后可以导致全身中毒[5]。HN2 常用来构建糜烂性毒剂中毒动物模型，以研究其中毒机制和防治策略[6]。

Mito-TEMPO 是一种具有线粒体靶向功能的超氧化物歧化酶模拟物，在线粒体局部具有较强的清除超氧化物和超氧阴离子自由基的能力，其化学结构式如图1 所示[7]。大量研究表明，Mito-TEMPO 被证实在多种损伤模型中能够减轻氧化应激损伤和细胞死亡[8-9]，同时还具有一定抗肿瘤作用[7]。Mito-TEMPO在糜烂性毒剂诱导的急性肺损伤中是否具有保护作用尚不清楚。本研究通过HN2染毒构建糜烂性毒剂诱导肺损伤体外模型，旨在明确Mito-TEMPO 干预对HN2 诱导肺上皮细胞毒性的作用，并初步探讨其作用机制，为糜烂性毒剂中毒导致的急性肺损伤的救治提供实验基础。

图1 Mito-TEMPO的化学结构式

1 材料与方法

1.1 实验细胞

BEAS-2B细胞系由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂Mito-TEMPO 购自中国MedChem Express(MCE)生物试剂有限公司；盐酸HN2(纯度99%)购自美国Sigma 公司；RPMI-1640 培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；PBS、0.25%胰蛋白酶购自上海吉诺医药生物技术有限公司；CCK-8细胞活性检测试剂盒、Annexin V/PI 双染凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；MitoSOX、DCFH-DA、DHE探针购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；ATP 含量检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自中国索莱宝生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒、RNA 反转录试剂盒、SYBR Green 一步法RT-PCR 试剂盒购自中国AG 生物科技有限公司。其他所用化学品均为分析纯以上级别。

1.2.2 主要仪器流式细胞仪为美国BD 公司产品；SCIENTZ-48 高通量组织研磨器为宁波新芝公司产品；全自动高速冷冻离心机购于美国Sigma 公司；Infinite M200 Pro 全波段酶标仪购于瑞士Tecan 公司；NanoDrop 2000分光光度计购于美国Thermo公司。

1.3 方 法

1.3.1 细胞处理和实验分组BEAS-2B 细胞在37 ℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度的孵箱中进行培养。当细胞生长至铺满70%~80%瓶底面积时，使用含0.25%的胰蛋白酶消化细胞进行传代或接种。Mito-TEMPO溶于DMSO中，配制为100 mmol/L储备液。盐酸氮芥直接溶解于RPMI-1640 培养基中，现用现配。Mito-TEMPO 干预HN2 导致细胞损伤实验中，分为正常对照组、Mito-TEMPO 对照组、HN2染毒组和Mito-TEMPO干预组(见图2)，其中正常对照组给予含DMSO(体积分数为0.1%)的无血清RPMI-1640 培养基处理26 h；Mito-TEMPO 对照组给予Mito-TEMPO(100 μmol/L)处理26 h；HN2染毒组首先给予含DMSO(体积分数为0.1%)的无血清RPMI-1640 培养基预处理2 h，然后给予HN2(8 μmol/L)染毒24 h；Mito-TEMPO干预组细胞给予Mito-TEMPO(100 μmol/L)预处理2 h，然后HN2(8 μmol/L)和Mito-TEMPO(100 μmol/L)进行共处理24 h。

图2 实验分组及方案示意图

1.3.2 CCK-8 法测定细胞活性将BEAS-2B 细胞接种于96孔板，当细胞生长至80%密度后，进行相应的实验处理。处理结束后，使用无血清RPMI-1640培养基将CCK-8 原液稀释10 倍，每孔加入CCK-8 使用液100 μL，37 ℃孵箱避光孵育0.5 h，然后用全波段酶标仪在450 nm处检测吸光度值D(450)，该吸光度值可间接反映细胞活性变化。

1.3.3 速率法检测细胞培养基上清LDH 活性使用商品化乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性检测试剂盒检测上清LDH活性：处理结束后，小心分离细胞培养基，1 000 g离心5 min，取上清，立即按照说明书步骤检测LDH活性。

1.3.4 Annexin V/PI 探针法流式细胞术检测细胞凋亡将BEAS-2B 细胞接种于6 孔板，当细胞生长至80%后进行实验。实验处理结束后，胰酶消化细胞，按照Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测FL-1 通道和FL-3 通道荧光强度。使用仪器自带CFlowPlus软件分析和处理数据。

1.3.5 荧光探针法检测细胞内ROS 水平和线粒体膜电位将BEAS-2B 细胞接种于6 孔板，处理结束后，吸弃细胞培养基，各孔加入终浓度为10 μg/mL 的MitoSOX、10 μmol/L 的DCFH-DA、10 μmol/L 的DHE、10 μmol/L的JC-1探针染料，37 ℃孵箱中避光孵育20 min，然后胰酶消化后离心，弃去上清后PBS重悬，流式细胞仪检测相关通道荧光强度，每样分别计数1×104个细胞。MitoSOX检测线粒体ROS，DHE检测细胞内总ROS，二者均计算红色荧光强度曲线下面积；DCFH-DA 检测细胞内H2O2，计算绿色荧光强度曲线下面积；JC-1探针检测线粒体膜电位时，计算红色荧光强度曲线下面积与绿色荧光强度曲线下面积之比。使用仪器自带CFlowPlus 软件分析和处理数据，每组实验独立重复3次。

1.3.6 紫外分光光度法检测细胞匀浆ATP 含量将BEAS-2B细胞接种于15 cm培养皿，按1.3.1的实验方案处理结束后，胰酶消化细胞，反复冻融5 次后，玻璃匀浆器制备细胞匀浆。BAC蛋白浓度检测试剂盒检测细胞匀浆蛋白浓度，使用商品化ATP含量检测试剂盒测定细胞匀浆ATP水平，实验步骤严格按照说明书进行，紫外分光光度法检测终末产物吸光值，ATP 单位为nmol/mg。

1.3.7 实时荧光定量PCR 检测mRNA 表达水平使用商品化通用型RNA 提取试剂盒提取细胞内总RNA，并使用NanoDrop 2000 分光光度计分析RNA 的浓度和纯度。鉴定纯度及浓度合格后，使用cDNA 合成超级混合试剂盒对提取的总RNA(2 μg)进行逆转录。反应条件如下：42 ℃、60 min，然后70 ℃、5 min。使用QuantStudio 7 Flex 实时PCR 系统和SYBR Green PCR master Mix 快速扩增试剂盒进行目的基因扩增，循环条件为95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s。mRNA 的相对定量值使用比较-Ct 法(ΔΔCt 法)。β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因。实验中所使用引物的序列信息见表1。

表1 基因引物序列

1.3.8 统计学方法实验数据采用xˉ±s表示，使用GraphPad Prism 8.0软件统计和分析数据，Tukey多重比较检验用于比较正常对照组和HN2 染毒组之间、HN2 染毒组和Mito-TEMPO 干预组之间的统计学差异，P＜0.05被认为具有显著的统计学差异。

2 结 果

2.1 Mito-TEMPO干预对HN2诱导细胞损伤的影响

首先，我们观察了Mito-TEMPO 单独干预对BEAS-2B 细胞活性的影响。CCK-8 检测结果见图3A，与未染毒细胞相比，25~400 μmol/L 的Mito-TEMPO 单独处理24 h 的细胞活性无明显改变(P＞0.05)，而800 μmol/L的Mito-TEMPO处理24 h的细胞活性降低了约16.4%(P＜0.05)。结合以往的文献，我们选择了100 μmol/L 作为Mito-TEMPO 的药物干预浓度。结合预实验结果，我们选择了8 μmol/L的HN2暴露24 h 构建体外损伤模型。如图3B 所示，与正常对照组相比，HN2染毒组的细胞活性降低了约19.2%(P＜0.05)。与HN2 染毒组相比，Mito-TEMPO 干预组细胞活性下降了约42.6%(P＜0.05，图3B)。培养液上清LDH活性结果见图3C，单独Mito-TEMPO 处理对细胞培养基上清LDH 活性无显著影响(P＞0.05)，与HN2 染毒组相比，Mito-TEMPO 干预组细胞培养基上清LDH活性显著增加(P＜0.05)，进一步证实100 μmol/L 的Mito-TEMPO干预对HN2诱导细胞毒性具有促进作用。

图3 Mito-TEMPO干预对HN2诱导细胞损伤的影响(n=8)

倒置显微镜观察细胞形态结果见图4，Mito-TEMPO 单独干预细胞形态基本正常，但HN2 暴露后细胞数量显著减少，且部分细胞呈现梭状，Mito-TEMPO 干预后呈现皱缩状态的死细胞数量明显增多。以上结果表明，100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干预对HN2导致细胞损伤具有一定程度的促进作用。

图4 倒置显微镜下观察Mito-TEMPO干预对HN2诱导细胞形态改变的影响(×40)

2.2 Mito-TEMPO干预对HN2诱导细胞凋亡的影响

Annexin V/PI 探针法检测细胞凋亡的结果见图5，与正常对照组相比，Mito-TEMPO单独处理对细胞凋亡无显著影响(P＞0.05)，HN2 染毒组的细胞凋亡率约为43.2%，与正常对照组相比显著升高(P＜0.05)，Mito-TEMPO干预组的细胞凋亡率约为51.4%，与HN2染毒组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

图5 AnnexinV/PI双荧光探针法检测Mito-TEMPO干预对HN2诱导细胞凋亡的影响(n=3)

2.3 Mito-TEMPO 干预对HN2 诱导线粒体功能障碍的影响

JC-1 探针法检测线粒体膜电位结果见图6A 和B，与正常对照组相比，Mito-TEMPO 单独处理对线粒体膜电位水平无显著影响(P＞0.05)，8 μmol/L HN2 暴露24 h 后细胞线粒体膜电位水平显著降低(P＜0.05)，100 μmol/L Mito-TEMPO 干预既未改善，也未恶化HN2 导致的细胞膜电位下降(P＞0.05)。细胞匀浆ATP含量检测结果如图6C所示，100 μmol/L Mito-TEMPO单独处理对细胞内ATP含量无显著影响(P＞0.05)，HN2染毒后细胞内ATP 含量显著降低(P＜0.05)。与HN2 染毒组相比，Mito-TEMPO 干预组细胞内ATP 含量无显著改变(P＞0.05，图6C)。

图6 Mito-TEMPO干预对HN2诱导线粒体功能障碍的影响

2.4 Mito-TEMPO干预对HN2诱导炎症反应的影响

RT-PCR 检测细胞内炎症因子TNF-α 和IL-6 mRNA 表达水平的结果见图7，与正常对照组相比，Mito-TEMPO 对照组TNF-α和IL-6 的mRNA 表达水平无显著改变(P＞0.05)，HN2 暴露组上述分子的mRNA表达水平显著上调(P＜0.05)。与HN2 染毒组相比，Mito-TEMPO 干预组细胞的TNF-α和IL-6 的mRNA 表达水平无显著影响(P＞0.05)。

图7 实时荧光定量PCR检测细胞内TNF-α和IL-6的mRNA表达水平

2.5 Mito-TEMPO 干预对HN2 诱导线粒体ROS、H2O2及总ROS的影响

MitoSOX 荧光探针检测线粒体ROS 水平的结果见图8A，与正常对照组相比，Mito-TEMPO 单独处理显著降低了线粒体ROS 水平(P＜0.05)，而HN2 染毒导致线粒体ROS 水平显著升高(P＜0.05)，与HN2 染毒组相比，Mito-TEMPO 干预组细胞线粒体ROS 水平降低了53.6%(P＜0.05)。DCFH-DA 荧光探针检测细胞内H2O2水平的结果见图8B，与正常对照组相比，Mito-TEMPO 单独处理和HN2 染毒均显著升高了细胞内H2O2水平(P＜0.05)，与HN2 染毒组相比，Mito-TEMPO干预组细胞内H2O2水平增加了171%(P＜0.05)。DHE荧光探针检测细胞内总ROS水平的结果见图8C，与正常对照组相比，HN2 染毒组细胞总ROS 水平升高了约47.2%(P＜0.05)，与HN2 染毒组相比，Mito-TEMPO 干预组细胞内总ROS水平升高了约43.4%(P＜0.05)。上述结果表明，虽然Mito-TEMPO 能够显著抑制HN2 导致的线粒体ROS水平的升高，但反而促进了HN2诱导的细胞内H2O2和总ROS水平的升高。

图8 Mito-TEMPO干预对HN2诱导线粒体ROS、H2O2及总ROS改变的影响(n=3)

3 讨 论

在战场条件下或化学恐怖袭击过程中，通过呼吸道大量暴露糜烂性毒剂可引起严重的急性肺损伤，目前其机制尚不明确，且缺乏有效的干预手段[3]。Mito-TEMPO作为一种新型线粒体超氧阴离子清除剂，已被证明在多种氧化应激损伤模型中具有较好的保护作用[10-11]。然而，Mito-TEMPO在糜烂性毒剂诱导肺上皮细胞损伤中的作用尚不清楚。在本研究中，我们通过细胞染毒HN2 构建了体外模型，以明确Mito-TEMPO是否可以减轻糜烂性毒剂诱导上皮细胞损伤并探讨其相关机制。这是首次在体外细胞水平上较为系统的评价线粒体靶向的超氧化物歧化酶模拟剂Mito-TEMPO对糜烂性毒剂诱导细胞毒性的实验研究。实验结果表明，安全剂量的Mito-TEMPO 干预并未有效减轻HN2诱导的细胞毒性，反而一定程度上促进了细胞损伤。

我们首先筛选了有效的Mito-TEMPO 干预浓度。通过CCK-8实验，我们发现除了800 μmol/L浓度造成细胞活性轻微损伤外，400 μmol/L 以下浓度的Mito-TEMPO均是安全的，未造成明显的细胞毒性。结合文献[12]报道，后续研究我们选择了100 μmol/L 浓度的Mito-TEMPO 进行体外干预研究，该浓度在多种模型中被证实具有良好的抗氧化保护效应[13-14]。通过CCK-8实验检测细胞活性，我们意外发现Mito-TEMPO干预后并未发挥保护作用，反而显著加重了HN2 诱导的BEAS-2B细胞活性损伤。细胞损伤后会释放LDH，培养基上清LDH 活性是评价细胞毒性的敏感指标[15]。LDH 检测结果与CCK-8 结果类似，进一步证实Mito-TEMPO 干预在HN2 诱导细胞毒性模型中发挥了促损伤作用。显微镜下观察细胞大体形态，也证实了上述结果。通过上述多种途径的交叉验证，我们证实100 μmol/L的Mito-TEMPO 与8 μmol/L的HN2共处理能够通过某种途径增强HN2的细胞毒性。

凋亡被认为是糜烂性毒剂导致肺损伤的重要中毒机制之一[16]。以往的研究表明，HN2 气管内暴露后能够导致肺泡上皮细胞发生显著凋亡[17]。有学者研究报道称，Mito-TEMPO 在对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤模型中，会引起一定的继发性肝细胞凋亡[18]。为了阐明凋亡是否参与了Mito-TEMPO 的促HN2 损伤效应，我们通过流式细胞术检测了凋亡细胞比例的改变，结果证实HN2 暴露能够显著诱导细胞发生凋亡，而Mito-TEMPO 处理既未促进凋亡，也未抑制凋亡，提示100 μmol/L 的Mito-TEMPO 促HN2诱导细胞毒性效应可能独立于凋亡作用。大量的研究证实，线粒体功能障碍在糜烂性毒剂诱导细胞损伤中发挥了关键的作用，其原因可能是通过烷化线粒体的DNA 和脂质，导致线粒体结构破坏，同时导致电子传递链功能异常，“电子漏”增加，同时也参与了氧化应激的发生和发展[19]。线粒体内主要的ROS 类型是超氧阴离子自由基，也是Mito-TEMPO作用的主要底物[9]。本研究证实HN2 暴露后导致BEAS-2B 细胞发生显著的线粒体功能障碍，表现为线粒体膜电位降低和ATP合成能力下降，但100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干预对HN2诱导线粒体功能异常既无改善，也无促进作用。糜烂性毒剂呼吸道中毒往往会导致肺部不可控的炎症反应[20]。HN2暴露不仅会导致肺泡灌洗液中的蛋白和炎症细胞显著增加[8]，还能引起细支气管周围区域、肺泡腔、血管和肺血管周围间质中性粒细胞明显聚集[9]。我们在体外模型中发现，HN2暴露后显著上调了上皮细胞中TNF-α和IL-6的mRNA水平，与以往报道的结论相一致[20]。以往的体内研究表明，Mito-TEMPO可以通过减轻炎症和线粒体功能障碍，缓解肾纤维化[21]，但在HN2 体外模型中，Mito-TEMPO 干预对炎症和线粒体功能反应均无显著影响，其机制还有待进一步阐明。

值得注意的是，我们的研究发现100 μmol/L 的Mito-TEMPO 虽然显著抑制了由HN2 染毒引起的线粒体ROS生成增加，但同时也明显促进了HN2导致的细胞内H2O2和总ROS的过量生成。这种现象可能是因为Mito-TEMPO 可以选择性地在线粒体中积累，主要发挥线粒体局部调控作用，通过高效的催化线粒体超氧阴离子生成大量H2O2[7]。大量文献表明，过量的超氧阴离子虽然能够导致氧化应激损伤，但适度水平可能在调节细胞功能方面发挥了信号转导等重要功 能[22]。大量的消耗线粒体ROS虽然可以减少线粒体局部氧化应激，但在细胞整体水平上可能会导致线粒体ROS信号传导功能的丧失。此外，由于Mito-TEMPO 干预组细胞内H2O2水平和总ROS水平显著升高，我们推测其原因可能是Mito-TEMPO 催化生成了大量H2O2，超出了细胞内过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶清除H2O2的能力，进而导致了大量H2O2蓄积，进而通过芬顿式反应等生成大量羟自由基等，导致细胞内ROS不可控的累积，最终导致HN2染毒细胞处于高水平的氧化应激状态并发生细胞损伤。大量研究已经证实，糜烂性毒剂暴露会通过线粒体氧化应激导致明显的线粒体结构异常和功能障碍[19，23]。虽然通过细胞毒性测试，我们证实100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干预增加了HN2 导致的细胞毒性，但后续的实验也说明Mito-TEMPO 并未促进HN2 相关的细胞凋亡发生和线粒体功能障碍。我们推测，虽然HN2 和Mito-TEMPO共处理通过提高总ROS水平诱导细胞整体水平的氧化应激损伤，但Mito-TEMPO 干预可能通过线粒体局部的高效抗氧化作用，有效拮抗HN2诱导过量ROS生成对线粒体的攻击，从而导致线粒体功能障碍和凋亡未出现明显改变。Mito-TEMPO 的促HN2 损伤效应可能是通过独立于凋亡和线粒体损伤作用发生的，主要通过损伤其他细胞器和诱导其他类型的细胞死亡。

综上所述，在HN2 染毒BEAS-2B 细胞的体外模型中，100 μmol/L 的Mito-TEMPO 干预表现出明显的促损伤效应，在这一过程中，Mito-TEMPO 干预显著抑制了HN2诱导的线粒体ROS的过量产生，却进一步提高了细胞内H2O2及总ROS水平，促进了细胞内氧化应激，进而增加了细胞毒性。Mito-TEMPO 的促HN2损伤作用可能独立于凋亡、线粒体功能障碍和炎症效应(图9)。本研究提示在糜烂性毒剂中毒救治中，不恰当的使用Mito-TEMPO 可能具有一定的风险和危害，也揭示了高剂量Mito-TEMPO 在临床使用可能出现的副作用及相关机制。生物体作为一个由多细胞、多组织和多器官构成的复杂功能体和生命体，毒物和药物的生物学效应和相互作用往往十分复杂，本研究目前仅在单一类型的细胞(BEAS-2B 细胞)上验证了单一浓度Mito-TEMPO(100 μmol/L)干预对单一浓度HN2(8 μmol/L)诱导细胞损伤的影响，还缺乏剂量-效应关系的深入探讨和多类型细胞的确切验证，需要进一步的补充和完善相关实验。为了深入阐明Mito-TEMPO对糜烂性毒剂诱导急性肺损伤中的药理学作用，我们将在HN2和硫芥染毒的体内模型中进一步客观评价其抗氧化功能和药理学作用。

图9 100 μmol/L的Mito-TEMPO干预对HN2诱导细胞损伤的影响