磁性管内固相微萃取—液相色谱测定血清中己醛和2-丁酮

王 莉， 严 玲， 黄小兰， 周红斌

(华中师范大学化学学院， 农药与化学生物学教育部重点实验室， 武汉 430079)

肝癌是第五大最常见的恶性肿瘤，其死亡人数超过乳腺癌、前列腺癌和结肠癌.早期治疗是提高患者生存率的关键，因此，寻找有助于早期诊断的生物源性物质具有良好的临床价值[1].肝癌患者唾液、血浆、血清和尿液中的2-丁酮和己醛出现异常，是癌症内源性生物标志物[2-3]，测定人血中微量的2-丁酮和己醛对肝癌的早期临床诊断具有重要意义.

高效液相色谱(HPLC)[4-6]和气相色谱(GC)[7-8]已被广泛应用于醛类和酮类的测定.然而，由于它们具有高挥发性、高活性，且缺乏发色团或荧光团，因此很难用HPLC直接分析[9].为了克服上述缺点，采用2，4-二硝基苯肼[10-12]和O-(2，3，4，5，6-五氟苯基)-羟胺盐酸盐[7，13]在检测前进行了醛、酮的衍生化.而2，4-二硝基苯肼是最常用的HPLC衍生化试剂.

考虑到血液样品基质的复杂性和血液样品中醛类和酮类的浓度相对较低，需要进行样品处理和富集程序来提高方法的灵敏度，如固相萃取[9，14]，液相微萃取[15]、聚合物整体柱微萃取[16-17]和固相微萃取[18-19].固相萃取作为样品前处理技术，是利用分析物在不同介质中被吸附的能力差将待测物提纯，有效的将待测物于干扰组分分离，具有萃取容量大、分离效果好的特点，但存在样品和溶剂消耗量大的缺点.液相萃取技术是一种根据萃取对象在萃取溶剂和样品溶液之间的分配平衡，将萃取对象浓缩至微升级的溶液内，实现萃取对象从复杂样品基质中分离和富集的萃取技术， 具有溶剂消耗量小的优点，但也有分离效果不高的缺点；固相微萃取是以固相萃取技术为基础的一种微萃取方法，通过将吸附剂涂层涂覆在石英纤维等的基体材料上，对目标物进行萃取和富集，以达到分离和提纯的目的，可以集采样、富集、进样于一体，但萃取效率不高；管内固相微萃取是固相微萃取的一种方式，管内固相微萃取是最初通过把吸附材料涂到石英毛细管的内壁上，具有萃取微型化、减少溶剂耗材等优点.本课题组以聚四氟乙烯管代替了常用的管内固相微萃取(IT-SPME)易碎的石英毛细管，实现了聚四氟乙烯管与高效液相色谱的结合，因为其具有丰富的现成接口和连接器，用聚多巴胺将天然无毒的双醛淀粉/壳聚糖复合涂层固定在聚四氟乙烯管内壁上，并在人血中原位衍生化2-丁酮和己醛[20].

然而，由于聚四氟乙烯管具有较高的耐化学性，很难将吸附剂固定在其内壁上.此外，血清样品不能直接使用IT-SPME进行提取，因为血清中大量的蛋白质会堵塞吸附剂的孔隙，大大降低了萃取效率.因此，在IT-SPME程序之前，应该先用传统的蛋白质沉淀程序除去大量的蛋白质.虽然蛋白质沉淀过程是快速和简单的消除血清样品中的蛋白质的一种策略，但这种技术的低选择性可能导致一些分析物的损失和共沉淀.因此，发展高通量、高灵敏、高选择性的分析方法需要寻找对血清中特定目标具有选择性的吸附剂和新型的聚四氟乙烯管萃取模式.

限进材料(restricted access materials， RAM)吸附剂通常由具有双官能团位于内外表面的多孔颗粒组成.亲水性和生物相容性的外表面结合一个可控的孔径作为一个物理屏障排斥大分子，而疏水性或离子交换的内表面为小分子量化合物提供结合位点，这些化合物可以自由地扩散到和出多孔颗粒.由于其亲水表面可防止蛋白质的不可逆吸附，RAM可作为一种低污染吸附剂，直接从富含蛋白质的基质中提取小分子[21-23].磁性核壳介孔二氧化硅纳米粒子可以作为这样的RAM吸附剂由于介孔二氧化硅壳可以提供一种控制孔隙大小排除大分子，并可能显示的分离性能和高效吸附由于其高表面积、均匀的孔隙大小、生物相容性和独特的超顺磁特性[24-25].然而，如何使其疏水内表面成为肝癌生物标志物(如2-丁酮和己醛的衍生物)在人血中的结合位点，以及如何在聚四氟乙烯管中进行萃取程序将被研究.

本文报道了一种新型的具有Fe3O4核和C8功能化介孔二氧化硅壳的磁性介孔吸附剂C8-Fe3O4@mSiO2及其在磁场作用下用聚四氟乙烯管从人血清中固相微萃取痕量2-丁酮和己醛的应用.将C8-Fe3O4@mSiO2吸附剂用2，4-二硝基苯肼预载在聚四氟乙烯管中，然后提取血清中的醛和酮，在吸附剂表面产生衍生物.大量的血清样本不需要经过预处理以去除蛋白质.新型吸附剂可直接提取，且不污染.此外，不需要将吸附剂固定在聚四氟乙烯管内表面.利用磁铁，磁性吸附剂可以在聚四氟乙烯管中进行提取程序，这有利于小而珍贵的样品，如血清和唾液.对影响萃取、衍生和解吸效率的几个参数进行了优化.在优化的条件下，建立了MITM-MSPE-ISD法，用于健康志愿者和肝癌患者血清中微量丁酮和己醛的测定.

1实验

1.1化学药品和材料

2-丁酮、己醛、正硅酸四乙酯、十六烷基三甲基溴化铵、正辛基三乙氧基硅烷(分析纯，阿拉丁).六醛二硝基苯酚和2-丁酮二硝基苯酚均为博纳安杰拉(天津)有限公司的高效液相色谱级产品.牛血清白蛋白(95%)是从上海瑞格尔生物技术有限公司获得的.2，4-二硝基苯肼、六水氯化铁、四水氯化铁、氯化钠、氢氧化钠、浓盐酸(分析纯，国药).使用前将2，4-二硝基苯肼在乙腈-水(V/V， 1/3)溶液中重结晶一次.甲醇(高效液相色谱级)和乙腈(高效液相色谱级)从美国费尔劳恩订购.

1.2仪器

JSM-6700F场发射扫描电子显微镜(SEM，日本JEOL公司)， JEM-100CXII透射电镜(TEM， 日本JEOL公司) ，Thermo Nicolet Is50 FT-IR傅里叶变换红外(FT-IR)光谱分析仪器(美国Boston， MA公司)，飞利浦MDR X射线衍射仪， PPMS-9振动样品磁力仪(VSM).Quantachrome IQ2系统孔隙度仪(美国康塔仪器公司) ，安捷伦1100高效液相色谱系统(美国安捷伦科技公司).超声波仪器KQ-100DE(江苏超声波仪器有限公司)， pHS-3C数字式pH仪(上海雷克斯仪器厂).

1.3样品制备和采集

如图1所示，首先，将六水氯化铁和四水氯化铁的混合物与浓氨水共沉淀法合成Fe3O4磁性纳米粒子.将2.7 g六水氯化铁和1.0 g四水氯化铁的混合物溶解在100 mL水中.然后在强烈搅拌下，滴加50 mL浓氨水，直至形成Fe3O4.在封闭的玻璃烧瓶中，在氮气气氛中油浴中不断搅拌，在80 ℃保持混合物4 h.得到的Fe3O4颗粒用去离子水反复洗涤，在50 ℃烘箱中干燥4 h.然后，将制备好的25 mg Fe3O4和50 mg 十六烷基三甲基溴化铵在25 mL去离子水中超声分散30 min，形成均匀的分散体系，加入200 mL 0.01 g氢氧化钠溶液再超声分散10 min.然后，在50 ℃强烈振动30 min后，向分散体系中加入1.25 mL正硅酸四乙酯/乙醇(V/V， 1/4)溶液，再加入0.05 mL正硅酸四乙酯和0.025 mL正辛基三乙氧基硅烷，在50 ℃持续振动12 h.产物用磁铁收集，用去离子水清洗和干燥.用丙酮在回流24 h下从产物中脱除模板十六烷基三甲基溴化铵将得到的C8功能化的棕色介孔Fe3O4@mSiO2纳米颗粒用磁铁收集，用乙醇和丙酮依次洗涤多次，然后在50 ℃烘干12 h.

2结果与讨论

2.1C8-Fe3O4@mSiO2的制备与表征

图1所示为中孔磁性C8-Fe3O4@mSiO2纳米颗粒的合成过程，包括Fe3O4磁性纳米颗粒的合成、介孔二氧化硅壳层的涂覆、C8功能化和模板去除.采用溶剂热法制备了形貌均匀、磁化强度高的亲水Fe3O4纳米粒子.然后介孔二氧化硅壳层和C8功能化Fe3O4表面的负电荷二氧化硅溶胶—凝胶有利于固定带正电荷十六烷基三甲基溴化铵胶束和正辛基三乙氧基硅烷修饰.

图1 C8-Fe3O4@mSiO2纳米颗粒的制备示意图.Fig.1 Schematic diagram of preparation of restricted-access C8-Fe3O4@mSiO2 nanoparticles

通过SEM、TEM、FI-IR和VSM对制备工艺进行了评价.通过扫描电镜和透射电镜观察Fe3O4和Fe3O4@mSiO2的形貌(图2).Fe3O4的SEM和TEM图像(图2a、2c)显示的是平均直径约为20～30 nm的微球.在SiO2包覆和正辛基三乙氧基硅烷功能化后，微球表面变得粗糙，粒径在60 ～ 75 nm之间(图2b、2d) TEM图像显示C8-Fe3O4@mSiO2的纳米结构由核壳球状纳米粒子组成，核约为20 ～ 30 nm，与Fe3O4的大小基本相同，壳层约为40 ～ 55 nm，包裹SiO2(图2e).

a. Fe3O4的SEM图像； b. C8-Fe3O4@mSiO2的SEM图像； c. Fe3O4的TEM图像； d. C8-Fe3O4@mSiO2的TEM图像 图2 磁性纳米粒子形貌Fig. 2 Morphology of magnetic nanoparticles

图3显示了Fe3O4和C8-Fe3O4@mSiO2纳米粒子的红外光谱.3 420 cm-1附近的宽带是Fe3O4羟基的弯曲振动特征.567 cm-1处的宽带是铁氧铁拉伸振动的特征，是磁铁矿Fe3O4的特征.在C8-Fe3O4@mSiO2的红外光谱中，1 050 cm-1和800 cm-1处的特征峰归因于线性Si—O—Si中Si—O的拉伸和两个硅原子关于其桥氧的对称振动，而在2 920 cm-1和2 850 cm-1处的吸收峰归因于正辛基三乙氧基硅烷的-CH2和-CH3基团的C-H振动.这些结果表明，由C8基团修饰的Fe3O4@mSiO2已经通过简单的溶胶—凝胶法成功地沉积在Fe3O4@mSiO2的壳层上.

图3 Fe3O4(a)与C8-Fe3O4@mSiO2(b) 介孔纳米粒子的FT-IR光谱Fig.3 FT-IR spectra of Fe3O4 (a) and C8-Fe3O4/mSiO2 (b) mesoporous nanoparticle

通过氮气吸附—解吸实验进一步证实了所制备的C8-Fe3O4@mSiO2的介孔结构，结果如表1所示.C8-Fe3O4@mSiO2的BET表面积、平均孔径和总孔体积分别为91.41 m2·g-1、12.99 nm和0.028 cm3·g-1，而Fe3O4的BET表面积、平均孔径和总孔体积分别仅为42.38 m2·g-1、1.212 nm和0.015 cm3·g-1，表明C8功能化二氧化硅涂层可以提高磁性Fe3O4微球的表面积、孔径和孔体积.因此，更多的小分子靶点被吸附到更大的孔中，在SiO2层外排除了大分子蛋白(大于14 nm).

表1 Fe3O4和C8-Fe3O4@mSiO2 纳米颗粒的结构参数Tab.1 Textural parameters obtained for the Fe3O4 and C8-Fe3O4@mSiO2 nanoparticles

2.2影响MIT-MSPE-ISD程序的因素

在实验中，优化了几个可能影响衍生化和萃取的参数，如2，4-二硝基苯肼的量、样品的酸碱度和C8-Fe3O4@mSiO2纳米粒子的量.在0.10～0.35 mL-1范围内研究了2，4-二硝基苯肼用量对效率的影响，2，4-二硝基苯肼浓度在50 μmol·L-1时保持不变.如图S1(见附录)所示己醛和2-丁酮衍生物的峰面积随2，4-二硝基苯肼量的增加而迅速增加，但在0.25 mL后增加速率减慢.表明2，4-二硝基苯肼与目标化合物反应完全.因此，选择浓度为50 μmol·L-1的0.25 mL 2，4-二硝基苯肼用于后续实验.

合适的酸碱度对醛酮和二硝基苯酚的衍生反应至关重要.已经发现衍生反应可以在酸性介质中加速以获得相应的腙.此外，pH值可能影响吸附剂和目标分析物之间的相互作用.因此，在pH为1.5 ～ 6.5的范围内，用磷酸盐缓冲液调节样品pH值，研究样品pH的影响，如图S2(见附录)所示羰基衍生物的峰面积在pH为3.5时达到最大.随着pH进一步升高，信号迅速下降.中性和弱酸性条件下衍生效率低可以解释这种下降.在酸性pH范围(1.5～3.5)下的稳定性信号表明，介孔SiO2改性涂层在pH范围内具有良好的化学稳定性，在整个实验过程中没有观察到酸性腐蚀或降解现象.为了获得较高的衍生化反应效率和稳定的萃取效率，本实验选择pH为3.5.

吸附剂的用量是影响MIT-MSPE-ISD性能的关键因素.通过C8-Fe3O4@mSiO2纳米颗粒的添加量(3～7 mg)考察C8-Fe3O4@mSiO2的添加量对萃取效果的影响.从图S3(见附录)中可以看出随着C8-Fe3O4@mSiO2纳米颗粒量的增加，被分析物的峰面积增加，然后曲线在5 mg以上略有下降.曲线上升的原因是吸附剂越多，有效吸收部位越多，吸附剂的吸收能力越强.下降的原因可能是解吸溶剂(丙酮)在解吸更多负载的C8-Fe3O4@mSiO2纳米粒子时挥发.更多的C8-Fe3O4@mSiO2纳米颗粒装载在管中，仅通过磁铁的运动进行重复的提取和解吸是不容易的.因此，采用5 mg C8-Fe3O4@mSiO2纳米颗粒对目标化合物进行提取，以保证萃取效率高，重现性好.

从理论上讲，低温不利于衍生化，而加热可以加速衍生化反应，提高醛酮衍生物的收率.反之，高温会使衍生物与物质的相互作用减弱，从而降低醛酮衍生物的萃取效率.因此，在20 ℃～ 60 ℃、0.10 mL·min-1流速下，考察了温度对MSPE原位衍生化的影响.如图S4(见附录)所示，低温将不利于衍生化，特别是对于酮，而加热可以加速衍生化反应并增加醛酮衍生物的产率，并且它们的峰面积在40 ℃时具有最大值，而过高的温度将降低吸附剂的稳定性并导致提取效率的降低.最佳衍生化时间为1.0 ～ 11.0 min.如图S5(见附录)己醛和2-丁酮的衍生率随着衍生时间的增加而增加，从1.0 min到5.0 min.当衍生时间超过5.0 min时，衍生过程中产生的杂质峰更多，因此使用5.0 min完成衍生.

甲醇、乙醇和乙腈、丙酮是常用的有机溶剂，用于从吸附剂中洗脱分析物.以丙酮为洗脱剂的解吸效果最好.在此基础上，优化了丙酮的体积为40 ～ 80 μL.所有分析物的峰面积从40 μL增加到50 μL，然后随着丙酮体积增大而减小，如图S6(见附录)，随着解吸溶剂用量的增加，解吸峰面积减小是由于稀释作用.因此，选择50 μL的丙酮进行解吸.在0.04 ～ 0.12 mL·min-1范围内考察了样品溶液的流速对萃取效率和衍生化反应时间的影响.从0.04到0.06 mL·min-1，醛酮衍生物的峰面积略有增加，如图S7(见附录)随着解吸流速从0.06到0.12 mL·min-1的增加，醛酮衍生物的峰面积略有减少.最后选择0.06 mL·min-1.总体而言，最佳条件为：0.5 mL样品溶液(含酸性磷酸盐缓冲溶液)中羰基用50 μmol·L-12，4-二硝基苯肼衍生，用5 mg C8-Fe3O4@mSiO2萃取5 min，以50 μL丙酮为解吸溶剂解吸.

为了研究磁性限进吸附剂的回收，在下一次使用之前，使用2 mL甲醇和2 mL水清洗C8-Fe3O4@mSiO2纳米颗粒.如图S8(见附录)，所示经过6次循环后，两种衍生物的峰面积都有轻微的减小.结果表明C8-Fe3O4@mSiO2吸附剂是稳定的，并且在MIT-MSPE过程中没有分析物的残留，显示出良好的可重用性.

2.3方法评价

为验证该方法，在最佳实验条件下，在空白血清基质中线性、检出限、重复性和回收率等基本分析参数进行了评价.在优化的实验条件下，制备一系列血清溶液，分别含有0.20、0.5、1.0、2.0、8.0、20.0和50.0 μmol·L-1，并进行提取和测定，建立校准曲线.如表2所示，在0.020 ～ 50 μmol·L-1浓度范围内呈良好的线性关系，线性相关系数(R2)均为0.999 1.以信噪比(S/N)为3和10的检测限和定量限分别为1.0 ～ 1.2 nmol·L-1和3.4～4.0 nmol·L-1.以日内和日间相对标准偏差表示的重复性在2.1% ～ 7.9%之间.利用相对回收率来评估该方法在两种不同浓度下的准确性.由表S1(见附录)可知，相对回收率为78.4% ～ 92.4%，对于痕量分析相对回收率的要求是70%～110%，即可表明方法的准确性，实验的相对回收率在100%以下并不存在系统误差.该方法的相对标准偏差(RSD)为3.2% ～ 7.3%，重复性在3.2%～ 7.3%之间，适用于血清样品中羰基化合物的分析.图S9(见附录)为肝癌患者和健康志愿者空白和加标血清样本的典型色谱图.常规的前处理方法是固相萃取(SPE)法.使用约100 mg ODS C18吸附剂(30 mm粒径)1 g为固定相，将之装入固相萃取柱中，结果表明固相萃取法的消耗样品和溶剂量大，不适合血液样品.因此，本实验未进一步进行比对分析.同时为了讨论所建立的方法在测定2-丁酮和己醛的实用性，与其他方法进行了比较.表3可以看出，该方法操作简便，抗干扰能力强，选择性高，检出限低.

表2 所开发方法的分析性能Tab.2 Analytical performance of the developed method

表3 本实验与其他方法的比较Tab.3 Comparison with other methods

2.4人血清样品中己醛和2-丁酮的测定

为了评价所建立的方法的性能，应用MIT-MSPE-ISD测定了15名健康志愿者和15名肝癌患者血清样本中的2-丁酮和己醛的浓度.分析结果见表4.可以看出，正常受试者的2-丁酮浓度在0.15 ～ 0.53 μmol·L-1，己醛浓度在0.14～0.71 μmol·L-1.2-丁酮和己醛的浓度分别为0.31～1.1 μmol·L-1和0.44 ～ 1.5 μmol·L-1.虽然肝癌患者血清样本中己醛和2-丁酮的浓度水平均有高于健康志愿者的趋势，但两组血清样本中两种羰基的浓度存在相当大的重叠.其原因可能与个人的饮食习惯、刷牙习惯、性生活、吸烟甚至生活环境等现象有关.因此，考虑到多种条件，需要进行更广泛的研究，目前正在对血清样品中其他挥发性有机化合物进行系统分析.

表4 健康人与肝癌患者血清结果分析Tab.4 Results of serum from healthy persons and liver cancer patients analysis

3结论

本研究成功制备了RAM C8-Fe3O4@mSiO2磁性纳米颗粒，并用于从人血清样品中提取2-丁酮和己醛.该材料结合了RAM和MNPs的优点，对小而珍贵的血清样品具有良好的抗干扰能力、高选择性，重复性合理，检出限低，为复杂生物样品中醛酮代谢物的定量分析提供了一种新的方法.