结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

谢燕玲，宁唤唤，梁 璇，康 健，任 瑞，张 慧，张娜娜，路延之，柏银兰

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)感染引起的一种危害严重的慢性传染病，是全球重点防控疾病之一。据WHO统计，2020年全球TB新发987万人[1]。加强TB早期诊断有助于TB的预防和治疗，因此，需要大力加强快速、敏感的TB诊断方法的研发。

TB诊断主要以临床检查和实验室诊断相结合，临床检查有胸部影像学和组织病理检查，实验室诊断包括细菌培养、涂片染色、核酸检测和抗原抗体检测等[2]。在细菌学检验中，Mtb培养阳性为“金标准”，但存在耗时长的缺点[3]。抗酸染色涂片阳性率较低，且不能区分Mtb及其他分枝杆菌。WHO推荐Xpert MTB/RIF技术用于TB快速诊断以及耐药性的检测，该技术仍存在易污染且无法区分活菌或死菌的不足[4]。在免疫诊断方法中，结核菌素皮肤试验(Tuberculin skin test，TST)是目前TB诊断运用较广泛的技术。TST以Mtb或卡介苗(BacilleCalmette-Guerin，BCG)培养物制成的结核菌素纯蛋白衍生物(Purified protein derivative tuberculin，PPD)为诊断试剂，通过检测皮肤迟发型超敏反应(Delayed-type hypersensitivity，DTH)辅助诊断TB。由于PPD包含分枝杆菌属共同抗原，因此，TST不能区分Mtb感染、BCG接种和非结核分枝杆菌(Non tuberculosis mycobacteria，NTM)感染[5]。BCG在制备过程中丢失多个基因区，称为差异编码区(Regions of difference，RD)，其编码的蛋白仅存在于致病性分枝杆菌中。以Mtb RD区编码抗原体外刺激外周血单核细胞，根据细胞产生IFN-γ水平辅助TB诊断，称为γ-干扰素释放试验(Interferon-γ release assay，IGRA)，是目前WHO推荐的免疫学诊断方法。RD区编码的抗原如ESAT-6、CFP10和MPT64等仅存在于Mtb中，因此，作为诊断试剂具有更高的特异性[6]。

MPT64是由Mtb的RD2基因座中Rv1980c(mpt64)编码的差异蛋白，主要存在于Mtb，以及少数牛分枝杆菌变异株和BCG Tokyo 172变异株，NTM少数菌株中如嗜血分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌等含有MPT64同源序列，与Mtb MPT64的同源性为65.9%～67.1%[7]。研究表明，MPT64能诱导Mtb感染豚鼠产生迟发型超敏反应，还能诱导免疫小鼠IFN-γ分泌显著增加[8]。因此，MPT64被认为是TB早期快速诊断试剂研制的候选抗原之一。现已建立qRT-PCR检测mpt64基因[9]、ELISA试剂盒检测MPT64抗体[10]；胶体金免疫层析法[11]和免疫PCR[12]检测MPT64抗原等方法。目前市场上在售的抗MTP64抗体有LifeSpan Biosciences公司(aa24-228)和Abcam公司(ab193435)，但均为兔多克隆抗体。因此，本研究采用原核表达载体获得纯化的重组MPT64蛋白，以该蛋白免疫小鼠，制备抗MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb)，为MPT64用于TB快速诊断试剂的进一步研制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21、DH5α菌株、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0由本室保存；6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自空军军医大学实验动物中心。质粒小量提取试剂盒、PCR清洁回收试剂盒购自Axygen公司；2×Taq PCR Mix、pMD19T载体等分子生物学试剂购自TaKaRa公司；异丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl beta-D-thiogalactoside，IPTG)、HAT和HT购自Sigma公司；Ni2+-NTA购自GE公司。RPMI 1640培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购自中杉金桥公司；其他常用生化试剂购自各生物公司。

1.2 原核表达载体的构建与鉴定 以Mtb H37Rv菌株基因组DNA为模板，设计引物F：5′-CGC-CATATGGTGCGCATCAAGATCTTC-3′(下划线为NdeI酶切位点)和R：5′-CGCAAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGTC-3′(下划线为Hind III酶切位点)扩增mpt64编码基因。用NdeI和Hind III酶切PCR产物，并与相同酶切的pET28a(+)载体用T4连接酶连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆提取质粒。分别进行酶切鉴定和序列测定(擎科生物)。

1.3 蛋白的诱导表达与纯化 将测序正确的重组质粒转化E.coliBL21感受态细胞。将阳性重组菌株接种至LB培养基中，于37 ℃、180 r/min过夜培养。按照1∶100的接种比例转接新鲜培养液，在终浓度为1 mmol/L的IPTG作用下诱导目的蛋白表达。制备菌体蛋白样品，12% SDS-PAGE分析目的蛋白的表达。蛋白电泳后，将菌体蛋白转印PVDF膜，以抗6×His mAb为一抗，Western blot法验证目的蛋白表达。重组菌扩大培养，收集菌体，采用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白，具体操作步骤参考课题组前期研究[13]。纯化的重组蛋白BCA定量后，-30 ℃保存备用。

1.4 单克隆抗体的制备 纯化的重组MPT64蛋白免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠，初次皮下免疫抗原50 μg/只+弗氏不完全佐剂；间隔两周，皮下免疫2次。第3次免疫抗原25 μg/只。免疫完成后4周，处死小鼠，制备脾细胞悬液，取对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，两者按照1∶5的比例进行细胞融合。融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，37 ℃、5% CO2培养。待细胞克隆出现后，取细胞上清以酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测抗体滴度，挑选阳性克隆。对含有阳性克隆的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。大量培养获得的杂交瘤细胞，接种小鼠腹腔制备腹水。

1.5 单克隆抗体的纯化 收集小鼠腹水，采用中压液相色谱仪纯化mAb。用平衡液(20 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.4)平衡HilTrap Protein A HP柱，腹水以0.22 μm滤膜过滤后上柱结合，平衡液洗涤，然后以甘氨酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 2.7)洗脱抗体。分段收集洗脱液，用中和液(1 mol/L Tris-HCl，pH 9.0)调整抗体溶液pH至7.0。12% SDS-PAGE电泳分析抗体的纯化。纯化的mAb加入20%甘油，BCA定量后分装，-80 ℃保存。

1.6 单克隆抗体相对亲和力和亚类鉴定 间接ELISA法检测抗体的相对亲和力及其亚类。10 μg/mL MPT64蛋白包被，加入梯度稀释的纯化抗体孵育，二抗分别加入HRP-山羊抗小鼠IgG、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b和IgG 3。抗体的相对亲和力计算参考文献[14]，具体如下：绘制以mAb浓度为横坐标，OD450为纵坐标的曲线，曲线上升至趋于平坦段的OD450值为100%，取其OD450值为50%时的mAb浓度表示相对亲和力。

1.7 单克隆抗体特异性检测 分别制备Mtb H37Rv(毒株)、Mtb H37Ra(减毒株)、BCG、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis，Ms)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)的菌体蛋白。12% SDS-PAGE电泳后，蛋白转印至PVDF膜上，分别加入稀释的抗MPT64 mAb、HRP-山羊抗小鼠IgG二抗，Western blot 法检测mAb的特异性。

2 结 果

2.1 原核表达载体的构建与鉴定mpt64基因大小为687 bp，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示，PCR扩增出预期大小一致的特异性条带(图1A)。将该片段克隆入pET28a(+)质粒，重组质粒，酶切鉴定显示与预期mpt64大小一致的条带(图1B)。测序结果表明，插入序列与Mtb H37Rv株基因组mpt64公布的序列完全一致，表明mpt64原核表达载体构建成功，命名为pET28a(+)-mpt64。

A：PCR扩增；B：酶切鉴定；M：DNA Maker图1 原核表达载体的构建及鉴定Fig.1 Construction and identification of the prokaryotic expression vector

2.2 目的蛋白的表达与纯化 天然MPT64的理论分子量为22 kDa，pET28a(+)-mpt64表达的蛋白带有6×His标签，分子量约为25 kDa。12% SDS-PAGE分析结果显示，含有重组质粒pET28a(+)-mpt64的细菌在IPTG诱导下表达目的蛋白，约25 kDa处出现表达蛋白条带(图2A)。Western blot分析显示，重组菌株在25 kDa处有与抗His mAb结合的条带(图2B)，表明成功表达MPT64蛋白。采用Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白，电泳分析结果显示获得了纯化的MPT64重组蛋白(图2C)。

A：MPT64表达的SDS-PAGE分析；B：Western blot鉴定；C：目的蛋白的纯化；M：蛋白Maker；1：未诱导菌体蛋白；2：诱导菌体蛋白；3：纯化的MPT64蛋白图2 MPT64的表达与纯化Fig.2 Expression and purification of MPT64

2.3 单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 通过有限稀释法筛选并获得一株能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞，命名为MPT64-A5B2。收集该杂交瘤细胞制备的小鼠腹水，中压液相色谱仪纯化MPT64-A5B2 mAb。mAb加入loading buffer后直接进行12% SDS-PAGE分析，结果显示相对分子量约150 kDa(图3A)；将样品煮沸后电泳，则分为重链(约50 kDa)、轻链(约25 kDa)(图3B)，与免疫球蛋白IgG的分子量大小一致。Western blot检测显示，mAb能够特异性识别纯化的MPT64重组蛋白，表明纯化获得了MPT64-A5B2 mAb(图3C)。

A：SDS-PAGE分析未煮mAb样品；B：SDS-PAGE分析煮沸mAb样品；C：Western blot分析；M：蛋白Maker；1：上样前平衡液；2：上样后平衡液；3：纯化的mAb；4、5：煮沸变性后的mAb图3 MPT64-A5B2 mAb的制备及纯化Fig.3 Preparation and purification of MPT64-A5B2 mAb

2.4 单克隆抗体相对亲和力及抗体亚类 ELISA检测MPT64-A5B2 mAb相对亲和力，如图4A，曲线上升至趋于平坦时的OD450值为0.704，记作100%，其OD450值为50%时的mAb浓度约为2.813×10-7g/mL，表明所得抗体相对亲和力较高。检测mAb的IgG亚类，结果显示该mAb属于IgG 1亚类，κ型轻链(图4B)。

A：mAb相对亲和力；B：mAb亚类图4 MPT64-A5B2 mAb的亲和力及亚类检测Fig.4 Affinity and subclasses of MPT64-A5B2 mAb

2.5 单克隆抗体的特异性检测 Western blot结果显示，MPT64-A5B2 mAb可特异性识别Mtb H37Rv和H37Ra菌体中22 kDa的天然MPT64蛋白；BCG在传代过程中丢失mpt64基因，Ms与Mtb MPT64的同源性仅为43.6%，而SA中无mpt64编码基因，因此无特异识别条带。纯化的重组MPT64蛋白为阳性对照(约25 kDa)。表明获得的MPT64-A5B2 mAb可区分Mtb、BCG和Ms，具有良好的特异性(图5)。

M：蛋白Maker；1：MPT64纯化蛋白；2：Mtb H37Rv菌体蛋白；3：BCG菌体蛋白；4：MS菌体蛋白；5：SA菌体蛋白；6：Mtb H37Ra菌体蛋白图5 MPT64-A5B2 mAb特异性分析Fig.5 Specificity analysis of MPT64-A5B2 mAb

3 讨 论

全球TB的高感染率和死亡率已引起公共卫生领域极大的重视。敏感且特异的早期快速诊断方法，有助于TB的控制。MPT64在TB感染动物体内可引发DTH反应，MPT64也可刺激TB患者外周血单核细胞IFN-γ释放量明显高于BCG免疫者[15]。因此，MPT64可用于TB的特异诊断试剂，且具有较高的特异性。

Mtb感染可诱导机体产生多种抗体。通过抗原-抗体检测方法检测机体抗Mtb特异性抗体，具有特异性好、敏感性高的优点。以抗Mtb IgG和IgA作为检测抗体，ELISA法检测患者血清，发现IgG诊断敏感性和特异性为76%和60%，IgA诊断敏感性和特异性为90%和71%[16]。目前用于TB诊断的抗原有pstS1(又称38 kDa蛋白)、Ag85复合物、HspX(又称16 kDa蛋白)[17]、ESAT-6、CFP10、MPT64、脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan，LAM)等。Ma等[18]以抗Mtb IgM包被ELISA板，建立间接ELISA检测法，发现采用ESAT-6、CFP-10、MPT64等蛋白作为检测抗原可区分TB患者与健康人，且MPT64的特异性(90.7%)高于ESAT-6(87.9%)和CFP-10(81.7%)。Xiao等[19]以MPT64作为抗原分别以酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunospot assay，ELISpot)和ELISA检测TB患者样品，结果显示ELISpot检测敏感性和特异性分别为66.67%和70%，ELISA检测敏感性为73.81%。因此，本研究构建了原核表达载体pET28a(+)-mpt64，诱导重组菌表达并纯化获得MPT64蛋白，该重组MPT64蛋白可用于Mtb抗体检测试剂盒的研究。

鉴定Mtb及其组分可以作为TB快速诊断方法。Sakashita等[20]分别采用Xpert MTB/RIF、抗酸染色法和鼠抗MPT64 mAb ELISA法检测患者痰液，抗MPT64 mAb ELISA法的敏感性(88%)高于Xpert MTB/RIF(84%)和抗酸染色法(84%)。抗MPT64 mAb ELISA法检测TB患者治疗14 d和28 d后血清，发现MPT64抗原含量随着抗TB治疗而降低，且该方法在3种检测方法中敏感性和特异性均最高[20]。Ida等[21]将兔CFP-10多克隆抗体(Polyclonal antibody，pAb)和豚鼠抗MPT64 pAb与金纳米颗粒结合，检测TB患者脑脊液、胸膜液和腹水，发现该方法诊断肺结核(89.3%)和肺外TB患者(78.1%)的敏感性显著高于Xpert MTB/RIF基因诊断技术，特异性高达97.9%～98.3%。肺外TB患者脑脊液检测中，基于抗MPT64 pAb为检测试剂的MPT64抗原检测试剂盒的阳性检出率(83%)高于Xpert MTB/RIF(67%)[22]。而Xpert MTB/RIF和MPT64检测的结合可以提高灵敏度[23]。有研究者使用38 kDa蛋白、ESAT-6、MPT64和Ag85复合物的mAb进行免疫组化检测，发现肠TB患者肠道组织中MPT64表达率为40.48%，显著高于38 kDa蛋白、ESAT-6和Ag85复合物[24]。本研究获得了一株能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。MPT64-A5B2 mAb相对亲和力约为2.813×10-7g/mL，能特异性识别Mtb H37Rv和H37Ra中的MPT64蛋白，而与疫苗株BCG以及NTM无交叉反应。基于mAb的测定可有效避免pAb检测所存在的批次间差异缺点，且所获得的MPT64-A5B2 mAb具有较好的特异性。MPT64基因在8种Mtb临床菌株中有63 bp(66-86 aa)的缺失，Xiao等[19]研究发现MPT64基因多态性对宿主免疫反应的影响不大。生物信息学预测MPT64抗原人B细胞表位共9个，MPT64临床菌株缺失区域仅累及B细胞表位中的2个(IEDB ID：103145和432168)。本课题组进一步将对MPT64-A5B2 mAb抗体识别位点进行鉴定，并收集相应突变的临床菌株进行检测，为该mAb用于TB诊断试剂的研制提供依据。

此外，研究发现，兔源抗HspX pAb通过适配体联合免疫吸附法(Aptamer linked immobilized sorbent assay，ALISA)可诊断胸腔积液(灵敏度可达93%)[25]，而人源HspX mAb对耐多药TB患者具有保护作用[26]。MPT64是Mtb短期或繁殖期培养分泌的主要抗原之一，占滤液总蛋白的8%，营养缺乏环境时MPT64表达下调，且MPT64与巨噬细胞炎症小体激活和凋亡相关[27]。因此，MPT64可能在Mtb感染早期起重要作用。本课题组将进一步建立动物感染模型，评价MPT64-A5B2 mAb用于阻断Mtb感染的紧急预防性治疗的研究。

利益冲突：无

引用本文格式：谢燕玲，宁唤唤，梁璇，等. 结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性[J].中国人兽共患病学报，2022，38(5)：387-393. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.052