苏木抗乳腺癌活性成分的筛选及其作用效果研究

梁永琴，杨喜花，，赵莉莉，陈丽霞 ，贺俊飞，张生万*

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西省肿瘤研究所 实验动物中心，山西 太原 030013）

0 引言

苏木是豆科云实属植物苏木（Caesalpinia sappan L.）的心材，是我国传统的中药。在国内主要分布于云南、海南、广西等地，在国外主要分布于地中海、非洲北部以及土耳其等［1］。《中国药典》记载其味苦、咸、微辛、性平，具有活血散淤、舒筋通络等功效，主要用于骨折伤筋、跌打损伤［2］等的医治。此外，国内外学者研究发现苏木提取物具有抗肿瘤［3］、抗氧化［4］、抗菌［5］、抗炎［6］、降血糖［7］以及免疫抑制［8］等作用。

乳腺上皮组织出现癌变细胞后，基因失去对其的调控而无限增殖，形成一种常见的恶性疾病——乳腺癌。近年来，全球乳腺癌的发病率和死亡率均呈现逐年上升趋势［9］，对人类健康和生命造成极大的威胁。因此，乳腺癌的治疗一直是人们在努力解决的问题。目前，乳腺癌的治疗模式为手术，辅助化疗或放疗［10］，化疗药物等有助于控制肿瘤的发展，但同时可破坏正常细胞，患者极易出现严重的不良反应［9］，而天然产物及其衍生物是各种药物先导化合物的重要源泉，故从活性天然产物骨架中寻找新药，是今后药物研发的重要途径［11］。

近年来，中药苏木已被证实对多种肿瘤细胞均有显著抑制作用［12-19］，其抗肿瘤机制的研究也愈加深入，大多是集中于苏木提取物抗肿瘤相关工作的研究，但中药成分极为复杂，对其抗肿瘤活性成分的筛选与鉴定研究相对较少。目前被分离鉴定的活性成分有巴西苏木素和原苏木素B，且针对膀胱癌的研究较多，如杨喜花等［20］研究表明苏木中活性成分原苏木素B可以抑制T24细胞，BTT细胞和5637细胞的增殖；张婷婷等［21］证实苏木中活性成分巴西苏木素可通过c-Fos和GADD45β介导的肿瘤细胞特异性信号通路抑制T24细胞生长并引发细胞凋亡。关于苏木提取物对乳腺癌是否起作用以及具体活性成分的研究鲜有报道，因此我们开展了苏木抗乳腺癌活性成分的筛选及其作用效果的研究，以期为苏木提取物以及其活性成分在临床上的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

苏木，安徽盛海堂中药饮片有限公司；甲醇，色谱纯，欧普森色谱纯试剂厂家；乙酸乙酯、石油醚、甲酸，天津市天力化学试剂有限公司；DMEM medium high glucose，BBI Life Sciences；Gibco RPMI1640培养基，Life Technologies公司；MTT，Solarbio公司；DMSO，Sigma公司；MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞、4T1细胞，山西大学生物医学研究院馈赠；巴西苏木素（质量百分含量达98%），由山西大学生命科学学院张生万教授提供。

1.2 实验仪器

Waters 1525高效液相色谱仪，美国Waters公司；2996 PDA检测器；Empower色谱工作站；Agela Venusil XBP-C18，Agela公司；FT-IR红外光谱仪，美国热电公司；ACB-4A1超净工作台，新加坡艺思高科技有限公司；CO2培养箱，Thermo Fisher Scientific；SunRise酶标仪，奥地利Tecan公司。

1.3 实验方法

1.3.1 苏木提取物样品的制备

苏木提取物的制备采用文献［12］的方法进行，即苏木药材经过煎煮提取，脱脂处理，萃取除杂，干粉精制后制得提取物。分别称取16份苏木干燥心材各500 g，经改变粒径（未粉碎或粉碎）、溶剂（水或体积分数为50%、60%、70%的乙醇）、料液比（1∶5、1∶6或1∶7）、提取时间（24 h或48 h）、提取次数（4次或5次）、脱脂次数（0次或1次）、萃取除杂次数（0次或1次）以及精制次数（0次、2次或3次），制得1-16号样品。

1.3.2 苏木提取物样品各组分相对含量的测定

准确称取1-16号被测样品各5 mg于5 mL容量瓶中，用18%的甲醇溶液定容，0.45 μm微孔滤膜过滤备用，采用液相色谱法测定并计算各组分相对含量。

高效液相色谱条件参照陈雪敏等建立的方法［22］，并按表1所示程序进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.3 苏木提取物对乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制率

采用MTT法［23］检测苏木提取物的1-16号样品对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的抑制作用。复苏MDA-MB-231细胞，用常规培养方法传代培养。取对数生长期、生长状况良好的细胞，于超净工作台内接种于两块无菌96孔板（1×105、0.5×105个/孔），每孔加入100 μL完全培养基后继续常规培养过夜。次日观察细胞贴壁完好，轻轻弃掉原培养基，处理组依次加入200 μL含苏木提取物的1-16号样品培养基（终浓度为 100 μg/mL），对照组不加药。并设立调零组，每组5个复孔。96孔板放入培养箱中分别培养24 h和48 h后，将所有孔内原培养基轻轻吸出，每孔加入含MTT的培养基（终浓度为0.5 mg/mL）100 μL，放入培养箱内继续常规培养4 h，小心去除孔内培养基，每孔避光加入150 μL DMSO，于酶标仪中振荡 10 min，使结晶充分溶解，并测定在490 nm波长下的吸光度（A）值，计算苏木提取物1-16号样品对MDA-MB-231细胞的抑制率。抑制率的计算如公式（1）：

1.3.4 苏木提取物抑制乳腺癌活性成分的筛选

以苏木提取1-16号样品的序号为横坐标，分别以苏木提取物各组分含量及其抑制率为纵坐标作图，考察苏木提取物的1-16号样品中各组分浓度和抑制率呈显著正相关（P＜0.05）者即为活性成分。

1.3.5 巴西苏木素对乳腺癌细胞MCF-7、4T1和MDA-MB-231的抑制作用

将乳腺癌细胞系MCF-7、4T1和MDA-MB-231用常规培养方法传代培养。取对数生长期、生长状况良好的上述乳腺癌细胞接种于96孔板（0.8×105、1×105、0.8×105个/孔），采用 MTT法［20］分别检测不同浓度巴西苏木素（终浓度分别为12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）对3种细胞的抑制率，计算3种乳腺癌细胞的半数抑制浓度（IC50）。并检测巴西苏木素在对 MCF-7、4T1和 MDA-MB-231作用的 IC50下对各细胞作用不同时间（3 h、6 h、12 h、24 h和48 h）的抑制率。IC50的计算见公式（2）：

其中，Xm：Ig最大剂量；I：Ig（最大剂量/相邻剂量）；P：阳性反应率之和；Pm：最大阳性反应率；Pn：最小阳性反应率。

1.3.6 统计分析

数据采用IBM SPSS Statistics 21软件统计，计量资料以xˉ±s表示，采用Pearson相关性分析；若数据呈正态分布，采用单因素方差分析，方差齐采用LSD检验，方差不齐则采用Dunnett’s T3检验，若呈非正态分布则用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苏木提取物样品中各组分含量的测定结果

苏木提取物典型的高效液相色谱图如图1所示，1-16号样品中对应各组分相对含量如表2所示。

由图1可知，在给定色谱条件下苏木提取物很好地分离，其主要组分保留时间分别为9 min、14 min、24 min、36 min和46 min的物质。由表2可以看出，不同提取方法所得的16种样品中，各组分浓度差异明显，能够进行活性成分筛选的相关性分析。

表2 高效液相色谱面积归一化法测定苏木提取物的1-16号样品中主要组分相对含量结果Table2 Determination of relative content of main components in No.1-16 Sappan L.extract by area normalization method of HPLC

图1 苏木提取物液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of extract of Sappan L.

2.2 苏木提取物对MDA-MB-231细胞抑制作用效果

苏木提取物的1-16号样品对MDA-MB-231细胞作用24 h和48 h的抑制效果见表3。

表3 苏木提取物的1—16号样品对MDA-MB-231细胞抑制率Table 3 Results of inhibition of MDA-MB-231 cells by No.1-16 Sappan L.extract

由表3可知：苏木提取物的1-16号样品对MDA-MB-231细胞作用24 h的抑制率均在50%以上，作用48 h时抑制率均明显提高，且多个样品抑制率高达95%以上，表明苏木提取物样品对乳腺癌细胞的抑制作用呈时间依赖性，并且各样品的抑制率有较大差异。

2.3 苏木提取物抑制乳腺癌的活性成分筛选结果

苏木提取物1-16号样品的抑制率结果如图2所示，相关系数如表4所示。

表4 苏木提取物各组分与MDA-MB-231细胞抑制率在不同时间下相关系数Table 4 Correlation coefficients between components of Sappan L.extract and inhibition rate of MDA-MB-231 cell at different times

图2 各组分含量对MDA-MB-231细胞抑制率相关性曲线（图b为图a的局部放大图）Fig.2 Correlation curve between the content of each compo‐nent and the inhibition rate of MDA-MB-231 cells（Fig.b is a locally enlarged image of Fig.a）

由图2和表4可知，苏木提取物保留时间为14 min的组分的含量变化与其对MDA-MB-231细胞作用24 h和48 h的抑制率变化趋势相一致，其余4种组分的含量与抑制率的关系不明显（图2（b））；且保留时间为14 min的组分含量与MDA-MB-231细胞抑制率呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.845和0.740故确定保留时间为14 min的组分是苏木提取物抗乳腺癌的主要活性成分。

2.4 苏木提取物抑制乳腺癌活性成分的结构鉴定

按1.3.1苏木提取样品的制备方法所得粗提物，经多次精制处理后的液相色谱图如图3所示，其保留时间为14 min组分的相对含量为98%，并经红外光谱测定其结果如图4所示，3 386.51 cm-1宽而强 的 νO-H峰 和 1 302.00 cm-1、1 230.64 cm-1强 的νø-o峰，表明该物有酚羟基的存在；1 158.45 cm-1强的νC-O峰，表明有叔醇羟基存在；3 036 cm-1的ν=ø-H和 1 622.32、1 598.49、1 507.71 cm-1的 νC=C以及 962.67、867.58、776.14 cm-1的 γø-H吸收 ，充分表明分子中有 1，2，4三取代和 1，2，4，5四取代苯基存在。且此样品红外图谱与文献［12］中巴西苏木素标准谱图一致，故确定其为巴西苏木素。

图3 精制样品的液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of refined samples

图4 精制样品的红外光谱图Fig.4 Infrared spectrum of refined samples

2.5 巴西苏木素对乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和4T1的抑制作用结果

实验考察了巴西苏木素在浓度梯度12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL下对MDA-MB-231、MCF-7和4T1三种乳腺癌细胞的抑制率见图5。

由图5可见，巴西苏木素在各浓度下对MDAMB-231、MCF-7和4T1三种乳腺癌细胞均有极显著的抑制效果（P＜0.01），且作用效果随作用浓度的增大而增加。巴西苏木素对MDA-MB-231、MCF-7和 4T1 作用的 IC50依次为 20.52 μg/mL、50.12 μg/mL 和 9.2 μg/mL。

图5 不同浓度巴西苏木素对三种乳腺癌细胞抑制率的影响Fig.5 Effect of different concentrations of brazilin on the in‐hibition rate of three breast cancer cells

巴西苏木素在半数致死浓度下对MDA-MB-231、MCF-7和4T1三种乳腺癌细胞分别处理3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后的抑制率结果见图6。

由图6可知，巴西苏木素在3 h、6 h、12 h、24 h和48 h下对三种乳腺癌细胞均有显著抑制作用，与对照组比较差异显著（P＜0.01），且巴西苏木素对3种乳腺癌细胞的抑制效果随着作用时间的延长而增加。

图6 巴西苏木素处理不同时间对三种乳腺癌细胞抑制率的影响Fig.6 Effects of different treatment times of Brazilian on the inhibition rate of three breast cancer cells

3 讨论

恶性肿瘤是重大的公共卫生问题，严重危害人类的健康。乳腺癌常见的疗法为手术联合放化疗法，但是化疗药物杀死肿瘤细胞的同时也会对机体正常细胞产生损伤，且药物易产生耐药性，严重影响治疗效果［24］。因此，寻求低毒、有效的治疗药物具有重要意义。中药药效广泛、毒副作用小，在治疗肿瘤的过程中，不仅可以通过调节多种分子机制缓解肿瘤引起的不良反应，发挥抗肿瘤作用，还可以提高机体免疫力，延长生存期［25］。由于中药化学成分极为复杂、药理机制众多，对中药多靶点之间相互联系了解不够深入，研究进程较为缓慢，故对其活性成分进行筛选与鉴定具有极为重要的意义。

本研究以中药苏木为研究对象，对其抗乳腺癌活性成分进行筛选，鉴定，验证。首先，将苏木提取物各组分含量与乳腺癌MDA-MB-231细胞抑制率的相关性研究表明，细胞抑制率与巴西苏木素含量呈正相关，且相关系数在0.740以上，故确定巴西苏木素是苏木中抗乳腺癌的主要活性成分。其次，用巴西苏木素对照品对以上结果进行了验证，结果显示，巴西苏木素对不同乳腺癌细胞均具有很好的增殖抑制活性，且呈剂量和时间依赖性。以上结果说明，苏木提取物中对不同乳腺癌细胞起抑制作用的活性成分为巴西苏木素，为乳腺癌的临床治疗、苏木活性成分巴西苏木素开发利用提供了科学依据。本课题组贺俊飞等对中药苏木抑制胃癌活性组分进行筛选，本研究在此基础上，对苏木抗乳腺癌的活性成分进行初步的筛选，并进一步经红外光谱对活性成分的结构进行鉴定，以3种不同的乳腺癌细胞为研究对象，对其作用效果进行验证，结果表明巴西苏木素对不同的乳腺癌细胞均有显著的抑制效果。