GNB2L1在宫颈癌中的表达及与患者预后的相关性分析①

马泽坤，李金秋，买迪努尔·买买提，素比努尔·吾布力卡斯木，祁光伟，郑博源，阿仙姑·哈斯木，林 晨

（新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830011）

宫颈癌是目前女性生殖系统恶性肿瘤导致死亡的主要原因之一，宫颈癌侵袭和淋巴结转移是导致疾病进展、治疗失败的重要因素[1]。宫颈癌晚期患者5年平均生存率为8%～12%，而早期或癌前疾病中被确诊的患者5年平均生存率为90%[2]。宫颈癌早期诊断和及时治疗可确保患者的良好预后，延长生存期[3]。宫颈上皮内瘤变和宫颈癌发生的主要原因是高危型人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）持续性感染[4]。因此，研究宫颈癌的发病机制，探寻与宫颈癌诊断治疗及预后相关的分子基因靶点至关重要。

鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β 多肽2 样蛋白1（GNB2L1）是由7 个色氨酸-天冬氨酸（WD-40）重复序列构成的β 片层结构域，能与多种蛋白质相互作用，介导细胞内的信号转导，直接参与重要基因的表达调控，影响细胞增殖、凋亡及迁移[5-7]。有研究表明，GNB2L1 在多种恶性肿瘤中高表达并与其不良预后密切相关，可作为影响细胞分化和代谢紊乱的新因素[8-10]。本研究探讨GNB2L1 在宫颈癌中的表达水平及作用，以期为宫颈癌患者的预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 组织样本收集2010年6月—2013年3月在新疆医科大学第一附属医院妇科收治的132 例宫颈鳞癌（CSCC）患者、56 例宫颈上皮内瘤变（CIN）患者宫颈组织，32 例无宫颈疾病患者正常宫颈（NC）组织。所有患者均进行妇科检查，按照国际妇产科联合会(FIGO)标准完成分期，并收集患者临床病理资料。所有患者均签署书面知情同意书，己过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（20180223-128）。

1.2 试剂与仪器SP 试剂盒、DAB 显色试剂（中杉金桥）；GNB2L1 siRNA（上海，吉凯）；RIPA 组织细胞裂解液（北京，索莱宝）；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（上海，Thermo Scientific）；兔抗人GNB2L1 多克隆抗体(美国，Abcam) 、兔抗人GAPDH多克隆抗体(武汉，ProteinTeach)、Quanti Nova SYBR Green PCR Kit 试剂盒与QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒(德国，QIAGEN)；胎牛血清、DMEM 高糖培养基（美国，Gibco）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒、Hoechst（上海，碧云天）；BODIPY（美国，Invitrogen）；实验仪器PCR仪与荧光定量PCR仪(美国，Bio-Rad）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学测定 将宫颈组织用4% 中性甲醛固定，石蜡包埋，烘烤、脱蜡、水化、抗原修复，加入内源性过氧化物酶抑制剂，室温下放置30 min。加入一抗，4°C孵育过夜；次日加入二抗，37℃孵育30 min，PBS 洗涤3 次，DAB试剂显色，苏木素复染，常规梯度酒精脱水，干燥，树胶封片。每张切片随机选取10个高倍视野进行观察，由2位病理科高级职称医师对切片进行综合评分，按照肿瘤细胞染色强度和分布进行半定量分析。得分9～12分为高表达，5～8分为中度表达，1～4分为低表达。

1.3.2 总RNA 的提取及qRT-PCR 技术 液氮中取出CSCC、CIN 及NC 宫颈组织，置于研钵中磨碎，利用TRIzol 等试剂提取组织中总RNA。采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒反转录为cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作内参，利用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒检测GNB2L1 基因的表达情况。GNB2L1 引物设计如下：GNB2L1-F：5'-TGAGTGTGCCTTCT-3'；GNB2L1-R：5'-GCTTGCAGCTTAGCCAGGTTC-3'；GAPDH-F：5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3'；GAPDH-R：5'-GT AGCCAGGCCGTGA-3'。反应结束后，保存溶解曲线、扩增曲线及对应Ct 值(达到阈值循环数)。采用RQ=2-△△CT法对数据进行相对定量分析。所有实验重复3次。

1.3.3 Western blot 测定 待细胞数量生长至≥1×106个时，经消化离心，取细胞沉淀，加入100µL RIPA 细胞裂解液，1µL PMSF，冰上裂解30 min，4℃，12000 r／min，离心15 min，收集上清；BCA 蛋白定量试剂盒测定细胞内总蛋白浓度；经蛋白定量及高温变性后，取出少量蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离90 min，90 V 稳压下经2 h电转至PVDF膜，加入封闭液，室温封闭30 min，4℃加入一抗孵育过夜（GNB2L1 抗体稀释比为1∶600；GAPDH 抗体稀释比为1∶5000），加入二抗孵育（1∶1000）2 h 后，采用ECL 法显色，使用化学发光仪进行拍照、蛋白灰度值扫描，与内参β-actin 进行比较，计算出GNB2L1 蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.3.4 基因组DNA 提取与DNA 拷贝数分析QIAamp DNA Mini Kit 试剂盒提取宫颈组织样本基因组DNA，并进行浓度测定，质检合格基因进行PCR 扩增，引物设计如下：GNB2L1-F:5'-GCAGCAACCCTATCATCGTC-3'；GNB2L1-R:5’-CGGTAGCCATTTCTCATTCA-3'，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带；切割产物亮带，将回收的PCR产物重组至pEASY-T1载体，将PCR阳性克隆样本送至乌鲁木齐欧易生物公司测序，确定阳性克隆，绘制标准曲线；采用qRT-PCR 检测样品Ct值数据，计算GNB2L1基因拷贝数。

1.3.5 细胞培养和慢病毒感染 将人子宫颈癌C33a、SiHa 细胞及人宫颈上皮细胞(H8)置于含10%胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素和链霉素）完全培养基的DMEM（高糖）培养液，37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞数量达到80%～90%时按照说明书进行操作。本实验转染所取的siRNA 的靶序列为：shGNB2L1-2:5'-GCAAGATCATTGTAGATGA-3'。以正常生长细胞为正常对照组，以空载慢病毒转染shNON 的细胞为阴性对照组，转染shGNB2L1 慢病毒的细胞为实验组，以备后续实验。

1.3.6 构建基因调控网络 利用生物信息学、STRING、TCGA 数据库构建相互作用网络，确定CSCC 中差异表达的基因相关的网络通路。根据文献[8]中蛋白组学和微阵列研究结果，选择表达一致的基因作为实验差异基因。将差异基因输入至STRING 数据库中，确定蛋白质亚基间的潜在关系，构建相互作用的网络结构。

1.3.7 BODIPY 染色 在6孔板中等量铺入C33a 和Si-Ha 细胞，每孔加入含10 %胎牛血清的DMEM 高糖培养液2 mL。待细胞贴壁，加入油酸储存液，24 h 后去除培养液，PBS 洗涤1次，5 min/次；4%多聚甲醛固定15 min，去除4 %多聚甲醛，PBS 洗涤3 次，3 min/次。每孔中加入BODIPY 荧光染料0.1 µg/mL，避光，37 ℃孵育，孵育20 min，PBS 洗涤3 次，5 min/次。每孔中加入浓度为1 µg/mL 的赫斯特染色剂，避光，37 ℃孵育15 min，PBS 洗涤3 次，5 min/次，在荧光显微镜下采集图像。实验重复3 次。

1.3.8 生存分析 电话随访收集患者术后生存信息，以患者死亡为终点事件，随访时间截至2020年12月31日。Kaplan-Meier分 析 和logrank试 验 分 析GNB2L1 蛋白的表达水平与患者总体生存期间的相关性，患者中位总生存期（OS）是指最初诊断为CSCC至死亡或最终随访的时间。

1.4 统计学处理采用SPSS 23.0、Graphpad prism 5.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以例（%）表示，采用卡方检验或Fisher精确检验分析GNB2L1 的表达与临床病理参数的相关性。t检验分析GNB2L1 在不同组织中的拷贝数。利用Image J 软件对BODIPY 染色平均荧光强度进行分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GNB2L1 表达水平与临床病理参数的关系qRT-PCR 实验结果显示，与CIN 组织（n=16 例）和NC组织（n=16 例）比较，CSCC 组织（n=16 例）中GNB2L1的mRNA 相对表达量较高，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图1A）；Western blot 结果显示，GNB2L1蛋白在正常宫颈组织、CIN1、CIN2、CIN3、宫颈鳞癌I 期、II期、III 期组织中的相对表达量分别为（0.253±0.005）、（0.516±0.002）、（0.789±0.007）、（0.926±0.005）、（1.152±0.003）、（1.274±0.005）、（1.400±0.015），差异有统计学意义（P＜0.01）（图1B、1C）。免疫组化结果显示，GNB2L1在NC、CIN 和CSCC 组织中表达呈现递增趋势（图2）。CSCC 组织中GNB2L1 蛋白的阳性表达率90.15%（119/132）显著高于CIN 组织66.07%（37/56）、正常宫颈组织43.75%（14/32）的阳性表达率，差异具有统计学意义（P＜0.01）；GNB2L1 高表达与临床分期(P=0.017)、淋巴结转移(P=0.049)、细胞分化程度(P=0.001)相关（表1）。

图1 GNB2L1 mRNA与GNB2L1蛋白的表达情况

图2 免疫组化检测GNB2L1蛋白在宫颈病变组织中的表达

表1 GNB2L1蛋白表达水平与临床病理特征的关系/例（%）

2.2 GNB2L1 表达与宫颈癌预后的相关性GNB2L1高表达患者的总生存期（43.13±1.65）个月显著低于GNB2L1 低表达患者的总生存期（63.39±2.28）个月，差异具有统计学意义（P=0.002）。

2.3 GNB2L1 基因拷贝数结果CSCC 组织中的GNB2L1 的DNA 拷贝数（297200±10815）copies/ng 显著高于NC 组织(215100±7276）copies/ng，差异具有统计学意义（P=0.009）。

2.4 GNB2L1 在正常宫颈细胞及宫颈鳞癌细胞中的表达Western blot 结果显示，GNB2L1 蛋白在SiHa、C33a、H8细胞中的相对表达量分别为（1.208±0.074）、（1.564±0.663）、（0.641±0.032），差异有统计学意义（P＜0.01）（图3A）。qRT-PCR结果表明，SiHa、C33a细胞中GNB2L1 的mRNA 相对表达量分别为(1.388±0.370)、(2.231±0.376)明显高于H8(1.000±0.000)细胞的表达，差异有统计学意义（P＜0.01）（图3B）。

图3 H8、SiHa、C33a中GNB2L1蛋白与mRNA的表达

2.5 GNB2L1信号通路调控与基因相互作用网络通过基因富集分析检测TCGA 数据库中GSE9750 和GSE68339，发现宫颈癌中GNB2L1 表达与侵袭转移特征存在相关性，将差异基因输入至STRING 数据库中发现，脂肪酸代谢相关的信号通路Akt/mTOR 和Jak-STAT参与GNB2L1的表达（图4A）。

2.6 BODIPY 染色结果实验组C33a 细胞和SiHa 细胞BODIPY 染色平均荧光强度低于阴性对照组和正常对照组细胞，脂质的生成水平明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01），（表2、图4B）。

图4 差异蛋白的网络分析及脂质合成情况

表2 各组细胞BODIPY 染色平均荧光强度比较/（±s，AU）

表2 各组细胞BODIPY 染色平均荧光强度比较/（±s，AU）

注：与正常对照组比较，*P＜0.01；与阴性对照组比较，△P＜0.01。

组别正常对照组阴性对照组实验组BODIPY 染色平均荧光强度C33a 64.750±6.24660.923±3.36236.532±2.884*△SiHa 70.106±1.05366.575±10.60735.857±7.392*△

3 讨论

GNB2L1 作为一种支架蛋白，在异常表达肿瘤细胞信号传导分子通路中发挥着重要作用[11]。研究显示，GNB2L1 在口腔鳞癌[12]、肝细胞癌[13]和胰腺导管腺癌[14]等多种癌症中高表达。在乳腺癌中，GNB2L1 可引起AKT 信号通路活化，促进癌细胞转移和增殖[15-16]。在恶性黑色素瘤细胞中，GNB2L1 可通过上皮间质转化（EMT）促进肿瘤细胞的侵袭和转移[17]。GNB2L1 也可作为预测口腔鳞癌患者预后的分子标志物[18]。有研究表明，GNB2L1 过表达可影响p53 信号通路，促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭[19-20]。本研究结果显示，与CIN 和NC 组织相比，CSCC 组织中GNB2L1的表达显著增高。较高的GNB2L1表达水平与宫颈癌FIGO 分期、淋巴结转移和细胞分化程度有关。说明GNB2L1 与肿瘤的发生、发展密切相关。GNB2L1高表达宫颈癌患者与GNB2L1低表达宫颈癌患者比较，其总生存期较短。提示过表达的GNB2L1可能与宫颈癌不良预后有关。基因拷贝数结果显示，CSCC 组织中GNB2L1的DNA 拷贝数显著高于NC组织，可能与宫颈组织中GNB2L1 蛋白差异表达有关。与H8 细 胞 比 较，C33a、SiHa 细 胞 中GNB2L1 mRNA 和蛋白表达水平均明显升高。 说明GNB2L1过表达与宫颈癌的发生发展密切相关。

虽然GNB2L1 与CSCC 的发生发展密切相关，但宫颈癌受复杂的多基因和多分子网络结构的调控，并且伴随各种肿瘤基因的协同作用，共同促进宫颈癌的发展。研究指出，GNB2L1 可通过Wnt/β-catenin信号通路上调cyclin D1 表达影响宫颈癌的淋巴转移能力，也可通过影响RhoA 激酶促进宫颈癌SiHa 细胞的侵袭能力[21-23]。本研究利用生物信息学、STRING数据库构建的交互网络结果显示，GNB2L1 与脂肪酸代谢相关的信号通路Akt/mTOR 和Jak-STAT 相互作用。提示上述信号通路可作为进一步深入研究的候选途径。GNB2L1 可与不同的信号蛋白结合，从而发挥不同的生物学功能[24-25]。文献报道，GNB2L1在脂质代谢中有调节PI3K表达和AKT磷酸化的作用[26]，推测GNB2L1 通过AKT/mTOR 信号通路调节脂肪酸代谢。本研究BODIPY 染色结果表明，GNB2L1能够增强细胞内的脂质蓄积，提示GNB2L1与脂质代谢有关。

综上所述，GNB2L1可能参与并促进宫颈癌的转移和进展，这有望为宫颈癌的诊断、治疗及预后评估提供一个新的分子靶点。