蕲蛇标准品DNA特异鉴定指纹片段的克隆及评价

赵万韬，包学英，李明成

(1.北华大学附属医院，吉林 吉林 132011；2.吉林省中药DNA指纹检测技术科技创新中心，吉林 吉林 132013)

蕲蛇为蝰科动物五步蛇(AgkistrodonacutusGuenther)的干燥体，其味甘咸、性温，具有祛风湿、散风寒、舒筋活络等药效[1].蕲蛇成长极慢，是我国一味传统名贵中药，又是食药同源品种之一.由于市场需求量大、货紧价高等原因，市场上各种充伪品屡见不鲜[2-3].2010年版《中国药典》收录了应用聚合酶链反应(PCR)法鉴别蕲蛇真伪，按照分子生物学鉴定技术要求，每次实验必须设置蕲蛇正品(即标准品)为阳性对照[4-5].正品蕲蛇药源珍贵，若每次实验都需要重新提取DNA，不仅费时、费力，且十分浪费[6].

本实验在《中国药典》收录蕲蛇PCR法鉴定基础上，对蕲蛇DNA进行提取，并对PCR鉴定试剂进行了改良，研制出蕲蛇DNA检测试剂盒[6].本实验尝试运用分子克隆技术，体外进行蕲蛇标准品特异DNA区段PCR扩增，与质粒载体重组，导入工程菌宿主细胞内，使特异片段在宿主细胞内通过自我复制而产生大量分子克隆，目的是使蕲蛇特异基因序列片段得到保存传代，确保蕲蛇分子生物学鉴定方法的专属性及特异度.

1 材料与方法

1.1 材 料

4批次蕲蛇正品药材分别采集天津(编号：TJQS-1、TJQS-1、TJQS-2)、北京(编号：BJQS-1)，所有样品经吉林市药检所金英兰主任药师鉴定，并依据《中国药典》收录的PCR方法鉴定均为正品，具体信息见参考文献[6].

1.2 试 剂

2×Taq PCR MasterMix(1 000 U)、pGM-T克隆试剂盒及质粒提取试剂盒(北京康润诚业生物科技有限公司)；大肠埃希菌DH-5α感受态细胞、LB固体和液体培养基(北京鼎国生物技术有限公司)；氨苄西林(AMP)、IPTG、X-gal(Sigma公司，德国).

1.3 仪 器

Gene AmpR PCR System 2700 PCR仪(Perkin Elmer公司，美国)；超微量紫外可见分光光度计Q6000(Quawell公司，美国)；紫外凝胶成像自动分析仪(Biorad公司，美国).

1.4 PCR扩增蕲蛇特异DNA片段

1.4.1 蕲蛇基因组DNA的提取

使用团队研制的中药材蕲蛇DNA检测试剂盒提取蕲蛇基因组DNA[6]，用紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度和纯度，用双蒸水将DNA提取液适当稀释，用于PCR反应模板.

1.4.2 PCR反应及琼脂糖凝胶电泳

参考文献[7]的方法进行PCR反应，结束后取产物10～15 μL，加在2%的琼脂糖凝胶(含GelRed)点样孔中，电泳30 min，结束后在紫外凝胶成像自动分析仪上记录结果.

1.5 PCR产物与pGM-T连接、鉴定

1.5.1 连 接

按照表1准备混合反应液，置于16 ℃水浴过夜，次日将离心管置于冰上.

表1 PCR产物与pGM-T连接反应体系Tab.1 System of PCR products and pGM-T ligation reactions

1.5.2 培养基的制备

制备LB液体和固体培养基，固体培养基含有AMP(75 μg/mL)，表面加入IPTG(50 mg/mL)16 μL、X-gal(20 mg/mL)40 μL，均匀涂开，避光，将其置于37 ℃放置1～3 h，备用.

1.5.3 转 化

取连接产物50 μL加到大肠埃希菌DH-5α感受态细胞中，混匀，冰浴30 min.42 ℃水浴90 s，立即置于冰浴2 min.加入37 ℃预热的LB液体培养基，120 r/min，37 ℃震荡培养.吸取100 μL培养完成的混匀菌液，加到LB固体琼脂培养基上，混匀涂开，37 ℃培养12～16 h.

1.5.4 鉴 定

挑选白色菌落接种3 mL LB(含AMP 90 μg/mL)培养基，37 ℃振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒按照说明书提取质粒，应用PCR及测序鉴定插入片段是否正确.

1.6 稳定性考察

将鉴定准确的携带正品蕲蛇特异DNA序列的菌落置于-80 ℃冰柜保存，30 d、60 d、3个月和6个月后复苏，采用煮沸法进行基因组DNA的提取，再用PCR扩增方法进行鉴定.

2 结 果

2.1 蕲蛇特异DNA序列克隆与鉴定

采用团队自行研制的试剂盒提取正品蕲蛇基因组DNA，经PCR扩增获得特异基因片段；同时，利用分子克隆方法获得正品蕲蛇特异DNA片段，经煮沸法提取蕲蛇DNA，进行PCR扩增，其结果为不同品种的正品蕲蛇PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，均在250～350 bp之间出现特异条带.见图1.

M.Marker；1.TJQS-3；2.BJQS-1；3.TJQS-1；4.TJQS-2；5.克隆后蕲蛇DNA；6.阴性对照.图1 蕲蛇正品PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agrose gell electrophoresis of PCR products

2.2 蕲蛇特异DNA片段序列克隆测序

将PCR鉴定含有目的片段质粒送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果登陆NCBI Nucleotide-BLAST在线比对，结果显示：送检片段的核苷酸序列与Genebank(AY223560)注册蕲蛇物种相似性均为99%(见图2)，证明本实验分子克隆后所得到的蕲蛇目的基因片段是正确的，克隆所得DNA片段即为蕲蛇目的基因片段.

图2 克隆后蕲蛇特异DNA测序结果与Genbank比对Fig.2 Comparison of DNA sequences and Genbank of Agkistrodon acutus Guenther

2.3 蕲蛇特异DNA序列克隆的稳定性考察

将携带正品蕲蛇特异DNA序列的工程细菌及用试剂盒方法提取、PCR扩增获得的含有蕲蛇正品特异DNA片段的溶液放置于-80 ℃冰柜内，保存30 d、60 d、3个月和6个月后复苏，分别进行独立实验，琼脂糖凝胶电泳图谱显示：随着时间的推移，试剂盒方法提取及PCR扩增获得DNA的浓度呈递减趋势，有的品种6个月后完全降解消失；而分子克隆方法获得蕲蛇正品特异基因片段的所有品种6个月后经PCR扩增后依然出现亮且清晰的目标条带.见图3.

M.Marker；1.TJQS-3；2.BJQS-1；3.TJQS-1；4.TJQS-2；5.克隆后蕲蛇DNA；6.阴性对照.图3 -80 ℃保存6个月的蕲蛇正品PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.3 Agrose gell electrophoresis of PCR products and molecular cloning assay stored at -80 ℃ for six months

3 讨 论

传统鉴别蕲蛇方法主要有基源、性状、显微及理化鉴别.基源和性状鉴别方法简便易行，但是需要鉴别者有丰富的专业经验.中药材蕲蛇在炮制等过程中会失去很多能够代表来源物种的信息，增加了鉴别难度，准确性也大大降低.显微鉴别方法适合以原粉入药的中药鉴别，蕲蛇多以同源动物作为伪品及混淆品，这些近缘动物的基本结构大部分非常相似，只有细微结构的微小差别，因此，用显微法鉴别蕲蛇具有一定困难[8].

近年来，以DNA分子为标记的中药分子鉴定方法得到广泛认可.生物体无论在生长发育还是经过人为加工，物种具有特定的DNA序列不会因环境变化而改变.因此，利用DNA指纹图谱鉴别具有独一无二的重复性，检测范围广泛，炮制或破损中药材对检测结果没有影响，也不依赖鉴别者的专业知识，特别适用于非专家物种鉴定[9-11].

本科研团队研制出川贝母、蕲蛇、乌梢蛇DNA检测试剂盒，建立了貂心、龟甲和鹿类产品PCR检测方法[12-15]，已广泛用于中药材正品与伪品的鉴别，不仅能够得到与药典相同的实验结果，也使DNA 指纹鉴定技术更加快速规范，可广泛地应用于药品生产企业和检验基层机构.《中国药典》鉴定蕲蛇DNA需要每次提供正品蕲蛇样品进行DNA提取，若每次使用的阳性对照品都从国家法定机构购买，势必增加鉴定成本.若自己购买蕲蛇药材用于阳性对照，因不能保证每次所使用的蕲蛇都是正品，每次使用时需要重新鉴定样品的真伪，浪费时间和精力.本科研团队利用微生物生长快速、繁殖量大、可传代等优点，使得细菌内的特异DNA片段得到长久保存，已经成功将川贝母DNA特异片段克隆并保存在细菌体内，用于川贝母鉴定和试剂盒生产[16].

本实验结果表明：利用分子克隆方法保存蕲蛇特异基因片段可行且有效，不仅节省了蕲蛇药源药材，而且即使反复冻融也对后续实验无干扰，确保了实验结果稳定性，同时也克服了传统方法所提取DNA片段容易降解的缺点.该成果为保存珍贵中药材特异基因序列、建立新中药正品基因库奠定了理论基础，推动了中药材DNA检测技术的发展[17-18].