油茶籽粉中茶皂素高效液相色谱测定方法研究

江勋 杨学军 邓小红 周峰 杨婷

【摘要】目的：建立测定油茶籽粉中茶皂素的高效液相色谱法。方法：色谱柱为Shimadzu Shim-packVP-ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-水（B）等度洗脱（35：65，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为265 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL，理论板数按茶皂素3个色谱峰计均不低于3000。结果：茶皂素质量浓度在390.0～3900.4 μg/mL（r=1.0000）范围内与其3个色谱峰面积和线性关系良好，平均回收率为100.57%，RSD为0.73%（n=9），精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD分别为0.05%、0.40%、0.33%。结论：所建立的方法专属性强、准确度高，可用于油茶籽粉中茶皂素的含量测定。市售不同产地、不同厂家的油茶籽粉中茶皂素含量差异较大，可能导致其洗涤效果差异显著。

【关键词】油茶籽粉;茶皂素;高效液相色谱;含量测定

【DOI 编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2022.02.010

Determination of Tea Saponin in Camellia Oleifera Seed Powder by HPLC

JIANG Xun，YANG Xue-Jun，DENG Xiao-hong，ZHOUFeng，YANG Ting

（Inspection and Testing Center，Hengyang Market Supervision，Hengyang China 421001）

Abstract：Objective：To establish a high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of tea saponin in Camellia oleifera seed powder. Methods：The chromatographic column was Shimadzu Shim-pack VP-ODS C18 column（250 mmx4.6 mm，5μm）. The mobile phase was methanol （A）- water （B）isocratic elution （35：65，V/V），the flow rate was 1.0 ml/ min，the detection wavelength was 265 nm，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 10 μL. The number of theoretical plates shall not be less than 3000 according to the three chromatographic peaks of tea saponin. Results：There was a good linear relationship between the mass concentration of tea saponin and its three chromatographic peak areas in the range of 390.0～3900.4 μg/ mL（r=1.0000）. The average recovery was 100.57%，RSD was 0.73%（n=9），and the RSDs of precision，stability and repeatability were 0.05%，0.40% and 0.33% respectively. Conclusion：The established method has strong specificity and high accuracy，and can be used for the determination of tea saponin in Camellia oleifera seed powder. The content of tea saponin in Camellia oleifera seed powder sold in different places and manufacturers may lead to significant differences in washing effect.

Key words：Camellia oleifera seed powder;tea saponin;HPLC;content determination

市場销售的油茶籽粉产品也主要作为一种天然清洁去污产品进行销售，各厂家同时也将其作为洁肤、洗发产品按化妆品用途作为宣传。国家现有标准GB/T 35131—2017《油茶籽饼、粕》对此产品的质量要求包含色泽、气味、水分、含油量、总灰分、杂质、茶皂素含量的检测[1]，其茶皂素的含量按照SN/T 1852—2006《出口茶皂素皂甘含量的测定》[2]进行测定，但此标准方法处于已经废止状态，茶皂素含量作为评价油茶籽粉洗涤效果的关键物质，缺乏相应现行有效、专属性强、准确度高的控制方法及控制指标。本研究建立一种专属性强、准确度高、操作简便的液相色谱法，现报道如下。

1仪器与试药

1.1仪器

Shimadzu LC-20AT型液相色谱仪，SPD-M20A型检测器，均购自日本岛津公司;AE240S型电子分析天平（瑞士梅特勒- 托利多集团公司，精度为十万分之一）;DK-615HT型超声波清洗仪（深圳市得康洗净电器有限公司，功率为360 W，频率为40k Hz）。

1.2试药及样品

茶皂素对照品（批号：CT224206，纯度为98.87%，合肥博美生物科技有限责任公司）;茶籽粉（北京博扬信科技有限公司，批号20210511;浙江宁波佰拉幕贸易有限公司，批号20210425;湖南娄底天之原有限公司，批号20200800;江西宜春芊盛农业开发有限公司，批号20210816;江西永丰农业开发有限公司，批号20210905）;甲醇（色谱纯，美国Honey Well公司，批号V4EG1H）;水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Shimadzu Shim-packVP-ODS C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：甲醇（A）-水（B），等度洗脱（35：65，V/ V）;流速：1.0 mL/min;检测波长：265 nm;柱温：30℃;进样量：10 μL。理论板数按茶皂素3个色谱峰计均不低于3000。在此色谱条件下，茶皂素的三个色谱峰均与各组分均能达到基线分离。

2.2溶液制备

取茶皂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含茶皂素3900.4 μg/mL的对照品溶液。精密称定样品1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入75%乙醇100 mL，密塞，称定质量，超声（功率为300 W，频率为40 kHz）处理40 min，取出，放冷，再称定质量，用75%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液。

2.3方法学考察

精密取2.2项下对照品溶液、样品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。理论塔板数以茶皂素三个色谱峰记，均大于3000，茶皂素三个色谱峰与相邻色谱峰分离度均大于1.5，基线分离良好。

标准曲线与线性方程：用75%乙醇稀释2.2项下对照品溶液，制成质量浓度分别为3900.4、3120.3、1950.2、780.1、390.0、0 μg/mL的系列对照品溶液，按2.1项下色谱条件各进样10μL，记录色谱图。以茶皂素峰面积（Y）为纵坐标、进样质量浓度（X，μg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程Y= 1611.2X-6565.5。

结果表明茶皂素质量浓度均在390.0～3900.4 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比（S/N=3）计算茶皂素的检测限，以信噪比（S/N=10）计算茶皂素的定量限，结果见表1。

精密度试验：分别取对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果茶皂素峰面积RSD为0.05%，（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品适量（浙江宁波佰拉幕贸易有限公司，批号20210425）按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、4、8、12、18、24h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录3个色谱峰面积和。结果RSD为0.40%（n=6），表明供试品溶液室温下放置24 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批样品适量（浙江宁波佰拉幕贸易有限公司，批号20210425），分别按2.2项下方法制备供试品溶液，平行六份，按2.1项下色谱条件进样测定。六份含量平均值为249.24 mg/g，RSD为0.33%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知茶皂素含量的同一批样品（浙江宁波佰拉幕贸易有限公司，批号20210425）九份，分别加入低、中、高质量浓度的茶皂素对照品适量，依法制备样品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算茶皂素含量及回收率。结果见表2。

2.4样品含量测定

取樣品约1.0 g，精密称定，依法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各10 uL，注入液相色谱仪，平行测定2次，以茶皂素三个色谱峰面积之和计算茶皂素含量，结果见表3。

3讨论

3.1流动相选择

预试验中，流动相考察了甲醇，甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水，采取甲醇作为流动相时各色谱峰分离度不佳，甲醇-0.1% 磷酸作为流动相时与甲醇-水洗脱效果相仿，但甲醇-水作为流动相配制、操作更为简便，且对色谱柱的保护效果更好，分离出的茶皂素三个色谱峰分离效果均良好，且流动相本身干扰小、稳定、可靠，故选择甲醇-水等度洗脱。

3.2测定波长选择

对照品和样品三个色谱峰全波长扫描光谱图（见图1）均在198 nm、265 nm、348 nm波长处呈现最大吸收峰，选取265 nm波长作为吸收色谱计算峰面积。

3.3提取方法选择

茶皂素又称茶皂甘，熔点约为224℃，平均分子式为C₅₇H₉₀O₂₆，相对分子质量约为1200～2800，是一种天然的糖昔化合物[4]，同时也具备这一类物质的通性——易溶于乙醇和甲醇，但难溶于无水甲醇和无水乙醇，不溶于石油醚、苯等有机试剂[5]。国内外提取茶皂素的方法主要有醇提法和水提法，由于水提法所得茶皂素纯度较低，不利于液相色谱的定量测定[6-7];采用乙醇-水混合溶剂浸提茶籽粉中茶皂素，既可以有效排除油茶籽粉中残油的干扰，又可得到高纯度茶皂素[8]，本文选择以75%乙醇为溶剂进行超声提取，方法简便，所得提取液中茶皂素纯度高、效果佳、干扰少，故选择75%乙醇作为提取溶剂，分别考察了提取时间30 min、40 min、50 min时茶皂素的含量，结果超声处理40 min可保证茶皂素得到充分的提取。

3.4样品分析

对收集到的5批不同厂家的油茶籽粉样品进行检测，发现其中茶皂素含量差异较大，最高者为266.06 mg/g，最低者为95.25 mg/g，其百分比含量为9.5%～26.6%，考虑到不同厂家生产的油茶籽粉中茶皂素含量差异可能与不同品种、不同产地、似但不如本法操作简便，本研究在文献基础上开发一种以甲醇-水（35：65，V/V）为流动相，专属性强、准确度高、操作简便的高效液相色谱法，为评价油茶籽粉中茶皂素的含量提供可靠依据。

3.5方法评价与讨论

茶皂素是天然表面活性剂，易于生物降解且不污染环境，是日用化工行业难得的表面活性剂原料。民间自古有用茶籽粉泡水洗衣、洗发的习俗，即茶皂素去污洗涤性能的具体应用。茶皂素性能柔和，其水溶液呈微酸性，以茶皂素为表面活性剂配成的洗涤剂，其起泡力优于肥皂或合成洗涤剂[11]，在日用化学品中常用于配制、生产高档洗发香波，具有洗发、护发双重功效，洗涤后头发光亮，手感爽滑、松软，易于梳理，对皮肤无毒害、无致敏作用，还可用于开发茶皂素洗涤剂，既能洗头、洗浴，又兼具养发、护肤功能，特别是使用后头发的伸长弹性和摩擦系数均优于其他合成洗涤类产品[12]。茶皂素还可作为头发生长促进剂，每天口服剂量20 mg，长期服用可使头发茂盛，并具有白发变黑的功效[13]。可见茶皂素可作为油茶籽粉的指标成分用以评价其质量和品质。

不同栽培技术、不同采收季节的油茶树籽及榨油工艺有关[9]，目前，茶皂素含量检测多采用分光光度法，其专属性不高，也有采用液相色谱法的其色谱峰分离效果不佳[10]，或选取甲醇- 0.1%磷酸为流动相进行液相色谱洗脱的其效果与本法效果相

油茶是世界四大木本油料，也是中国所特有的油料物种，有着两千多年栽培和利用历史。全球油茶产量95%以上来自中国，主要分布在华南、华中和西南14个省（自治区，直辖市），湖南、江西、广西、广东、福建、湖北、浙江、贵州、安徽、云南为重点栽培省份[14]，中国油茶将近一半来自湖南，形成了“世界油茶看中国，中国油茶看湖南”总体趋势。我国各类茶籽资源十分丰富，利用潜力巨大，油茶产业已经成为具有巨大发展潜力的朝阳产业，其经济、社会、生态效益极高，开发油茶籽粉中茶皂素的应用具有重要的现实意义和十分广阔的前景，可广泛应用于食品、工业、医药、化妆品等领域[15]。根据国家林业和草原局公布数据，目前我国茶油年产量约100万吨，经压榨过后的油茶籽饼约60万吨[16-17]，将油茶籽饼加工成油茶籽粉是一条理想的油茶工业副产品开发利用途径。随着人民生活水平的日益提高，油茶籽粉这类无添加的天然洗洁粉将得到越来越广泛的重视。以茶皂素作为油茶籽粉的指标成分，采用本研究建立的液相色谱法进行质量控制，方法简便、准确，为油茶工业副产品的开发利用奠定基础。

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