亚低温状态5周游泳运动预防非酒精性脂肪肝大鼠肝组织匀浆指标的变化

秦智 周敏 王晓昆

探讨在SD大鼠NAFLD模型建造前，对其实施亚低温状态下游泳运动干预，实验研究预防NAFLD的效果和机制。方法：40只SD大鼠随机分为对照组（control，C）、高脂组（fat，F）、亚低温游泳高脂组（hypothermia swimming fat，HS）和常温游泳高脂组（temperature swimming fat，TS），每组各10只。第0-5周，各组统一给予普通饲料喂养，TH和TS组实施游泳运动干预。第6-10周，F、HS和TS组采用高脂饲料喂养建造NAFLD动物模型，C组继续给予普通饲料喂养。第10周结束，处死各组SD大鼠，检测肝脏组织中MDA、SOD、GSH和Caspase-3、Caspase-12、TNF-α、IL-6、HSP70的表达。MDA、Caspase-3、Caspase-12、TNF-α和IL-6五项指标，F组比C组显著升高（p<0.05）;HS组则有显著性降低（p<0.05）;TS组MDA、Caspase-3和Caspase-12相比F组均有降低，但是无显著性差异（p>0.05），TNF-α和IL-6相比F组均出现显著性降低（p<0.05）。F组GSH和SOD比C组有非常显著性降低（p<0.01），HS组比F组显著上升（p<0.05），TS组比F组升高，但是均无显著性差异（p>0.05）。结论：5周亚低温状态下游泳干预组相比常温游泳组SD大鼠NAFLD动物模型更具有显著性预防或减轻非酒精性脂肪肝发生的效果。

随着人类生活水平提高和运动的减少，非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）在全球高发，其平均发病率20%左右。临床上，针对NAFLD的治疗仍然缺乏特效药。21世纪，我国的卫生服务将属于卫生保健型体制，突出预防为主和群众性的自我保健，许多医院都开设了未病科。探讨预防NAFLD机制的研究是运动医学研究领域最受关注的热点之一。近年来，研究表明：低温具有抗炎、镇痛和提高免疫力等功能。亚低温状态特指：动物直肠温度维持在33℃左右，比常温动物直肠温度平均相差3～4℃。整合应用亚低温状态联合有氧运动或许成为预防NAFLD的有效手段。本研究采用在SD大鼠NAFLD模型建造过程前，通过观察亚低温状态5周游泳运动预防非酒精性脂肪肝大鼠肝组织匀浆各项指标的变化，旨在探讨研究预防NAFLD 的方法，为探寻预防NAFLD有效措施研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 NAFLD动物模型的建造

借鉴美国Charles等研究和预实验结果，本实验采用高脂液体饲料喂养SD大鼠（供给能量分别为脂肪71%，碳水化合物11%，蛋白18%），5周后取材制备肝组织切片HE染色，完成NAFLD动物造模。

1.2 实验动物与分组

实验动物：3月龄SPF级雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠40只，体重200±20（g），由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0002粤监证字2008D007。每笼4-5只，饲养温度20±2℃，湿度55%左右。大鼠适应性饲养（普通饲料）一周后，随机分为对照组（control，C）、高脂组（fat，F）、亚低温游泳高脂组（hypothermia swimming fat，HS）和常温游泳高脂组（temperature swimming fat，TS），每组各10只。第0-5周，各组统一给予普通饲料喂养，HS组和TS组实施游泳运动干预。第6-10周，F、TH和TS组采用高脂饲料喂养建造NAFLD动物模型，C组继续给予普通饲料喂养。在实验开始之前（第0周）、5周游泳干预结束之后（第5周），以及第6-10周NAFLD模型建造结束后（第10周）分别对各组大鼠进行称重，并观察了其运动和生活的一般状态。

1.3 游泳运动强度设置方案

本研究游泳方式为无负重，游泳场地为内壁光滑的大水桶，水桶高为70cm，直径60cm，水深55cm。每次每桶5只大鼠进行游泳运动，确保每只大鼠的游泳面积均大于500cm2。HS组水温28±1℃，TS组水温33±1℃。参照Iemitsu Motoyuki等的实验模型结合预实验结果设置本研究运动强度方案：HS和TS组大鼠第一天开始进行泳训练15min，在1周内逐渐增加至每天1小时的游泳运动，每周6天，共计5周的游泳运动时间。训练过程中，HS和TS组各有1只大鼠溺水死亡，解剖尸体诊断无其他疾病，故第10周末，HS和TS组的样本量均为9只。

1.4 亚低温设置方案与监测设备

参照于立君等文献结合课题组预实验结果，设置HS组大鼠直肠温度维持在33℃左右 ，而TS组大鼠肛温维持在37℃左右，两组大鼠间肛温平均相差3～4℃。因此，设置室内温度为30±1℃、常溫水温度为33±1℃、亚低温干预水温度为28±1℃。

1.5 肝组织匀浆指标测试

第10周末，各组大鼠禁食12h后处死取材。将肝组织制成10%组织匀浆，取上清备用。按照试剂盒说明书：肝组织丙二醛（MDA）采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）采用黄嘌呤氧化酶法，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）采用比色法测试。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）采用固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）测试，肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）采用双抗体夹心ELISA法测试。

1.6 统计学分析

实验数据用均数±标准差（M±SD）表示，组间比较采用t检验，各均值用多个Independent-Samples T Test;关联度高的反映同功能的生理指标则采用Paired-Samples T Test 处理，显著性差异为P<0.05，非常显著性差异为P<0.01。

2 实验结果

2.1 各组体重的变化

第0周和第5周各组之间体重无明显差异（见表1）。第10周，F组体重比C组明显上升P<0.05，HS和TS组体重比F组呈显著性下降P<0.05。各组大鼠在NAFLD造模前精神状态和活动度均良好，且无明显差异。第6-10周，随着NAFLD造模进行，F组大鼠活动度明显降低。其他生活状态均无差异。

2.2 各组肝脏形态学变化

第10周处死各组大鼠，取肝脏进行大体进行观察，并取相同部分进行HE染色观察病变。如图2所示，C组肝脏光滑完整，F组可见明显多个散发的脂肪囊肿，HS组肝脏较为光滑，偶见个别小脂肪囊肿，TS组肝脏靠近肝门处脂肪囊肿散发。HE染色所示：C组肝小叶结构清晰完整，可见明显有规律排列的肝细胞索;F组肝小叶与肝细胞索消失，肝细胞内可见大量（>90%视野）脂肪小空泡，伴有多发大空泡融合成大小不一的脂囊;HS组肝小叶结构尚可见，但肝细胞索结构有些紊乱。肝细胞内可见中量（>50%视野）脂肪小空泡，偶有融合性大空泡出现;TS组肝小叶结构紊乱不清，肝细胞内可见较多（>75%视野）脂肪空泡，肝细胞体积增大，胞浆疏松呈网状、半透明。

2.3 肝组织匀浆指标的变化

如表2所示，F组肝组织MDA比C组非常明显升高（P<0.01）;而GSH、SOD的表达则比C组显著降低（P<0.01）。HS组肝组织MDA比F组显著降低（P<0.05）;GSH、SOD的表达比F组显著上升（P<0.05）。F组肝组织Caspase-3和Caspase-12比C组显著升高（P<0.01）;而HS组肝组织Caspase-3和Caspase-12的表达比F组显著降低（P<0.05）。TS组肝组织MDA、GSH、SOD 、Caspase-3和Caspase-12与F组相比，均无明显性变化（P>0.05）。F组肝组织TNF-α和IL-6比C组显著升高（P<0.01）;而HS组TNF-α和IL-6的表达比F组明显降低（P<0.01）;TS组肝组织TNF-α和IL-6比F组显著降低（P<0.05）。

3 讨论

本研究归纳认为：现在广大研究者广泛认可的NAFLD致病机制是“二次打击假说”。第一次打击是脂肪蓄积在肝中，这个过程的发生和胰岛素抵抗有着紧密的联系，这也是为什么许多研究者并没有在脂肪肝患者中发现大量或严重的炎症改变。第二次打击是源于氧化应激诱导的级联反应促线粒体细胞凋亡与内质网应激，再加上细胞因子的异常分泌从而导致了NAFLD炎症反应的发生和发展以及坏死、纤维化最终演变为NASH。

诸多研究初步证明，有氧运动（aerobic exercise）可通过减少机体受自由基损伤的程度来增强机体抗氧化防御功能;从“适宜运动”理论来看，20分钟有氧运动组的运动强度在各运动组中最为合适，这种适宜的运动形式产生积极的运动效应的机理与运动诱导细胞凋亡的机制正相反，表现为：①适宜的运动促进bcl-2基因表达、抑制bax基因表达、使bcl-2/bax比值发生优化，②适宜的运动可以减少自由基的生成，并通过提高SOD等抗氧化酶活性加大对自由基清除的力度 ，③使线粒体体积和数目的同时增加，酶合成增加，增强活性和线粒体氧化磷酸化能力，④减少机械损伤的发生;在国内文献中，鲜有相关报道。关于有氧运动介导的抗炎症反应机制，大多集中在IL-6和TNF-α两种细胞因子。

低温医学集组织学、工程学、医学之大成，发展成为一门新兴边缘学科。低温具有抗炎、镇痛、散热及提高机体免疫力等广泛、综合生物学效应，已广泛应用于各项运动训练后的康复治疗。它还应用于治疗炎症，肌肉痉挛和疼痛。

本研究结果显示，HS组肝组织MDA的表达比F组显著降低（P<0.05）;HS组肝组织GSH、SOD同F组比较，有显著性升高（P<0.05）。在建造NAFLD动物模型前，预先实施亚低温状态下联合有氧运动干预措施，可以明显增强肝细胞抗氧化应激能力。这可能是由于有氧运动能增加机体SOD等抗氧化酶的数量和活性，亚低温状态使得机体生成氧自由基的数量减少，而实施亚低温状态下联合有氧运动干预措施，可能会使得NAFLD肝细胞抗氧化应激能力产生叠加效应。

本研究结果显示，HS组肝组织Caspase-3和Caspase-12的表达比F组明显降低（P<0.05）。在建造NAFLD动物模型前，预先实施亚低温状态下联合有氧运动干预措施，可以明显减少NAFLD肝細胞线粒体凋亡与内质网应激的发生。这些可能与上述NAFLD血清FFA减少和肝细胞抗氧化应激能力的提高有关。

本研究结果显示，HS组肝组织TNF-α和IL-6的表达比F组显著降低（P<0.01）。在建造NAFLD动物模型前，预先实施亚低温状态下联合有氧运动干预措施可以明显减少NAFLD肝细胞炎症因子的生成，达到预防NAFLD炎症的形成。

4 结语

在SD大鼠NAFLD模型建造前，实施亚低温状态下游泳运动干预5周，可以减少肝细胞线粒体凋亡与内质网应激的发生、增强肝细胞抗氧化应激能力和减少肝细胞炎症因子的生成，从而达到预防NAFLD的发生的效果。

本文系2018年度湖北省教育厅科学研究计划资助项目“不同运动形式对非酒精性脂肪肝的干预作用及机理”（B2018226）。

通讯作者：王晓昆

（作者单位：1.武汉体育学院运动医学院;2.武汉航海职业技术学院）