高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中9种磺胺类药物残留不确定度的评定

张慧芳 孙文

摘 要：建立了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）测定牛奶中9种磺胺类药物的数学模型，并对测定过程的不确定度进行了评估。当牛奶中磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺异噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的含量分别为21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1时，扩展不确定度分别为0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1（k=2）。结果表明，影响检测结果的主要因素是标准工作曲线，其次是重复性。

关键词：高效液相色谱-串联质谱法;磺胺;牛奶;不确定度

Uncertainty Evaluation of 9 Sulfonamides Residues in Milk by HPLC-MS Method

ZHANG Huifang， SUN Wen*

（Institute of Food and Grain Inspection Technology， Shanxi Inspection and Testing Center， Taiyuan 030012， China）

Abstract： A mathematical model for the determination of nine sulfonamides in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS） was established， and the uncertainty of the determination process was evaluated. When the contents of sulfadimidine， sulfadiazine， sulfapyridine， sulfamerazine， sulfisomidine， sulfameter， sulfamethoxazole， sulfisoxazole and sulfadimethoxine in milk were 21.272 μg·L-1， 22.336 μg·L-1， 19.352 μg·L-1， 21.312 μg·L-1， 20.840 μg·L-1， 22.680 μg·L-1， 20.456 μg·L-1， 21.816 μg·L-1 and 18.208 μg·L-1， the expanded uncertainties were 0.323 2 μg·L-1， 0.255 8 μg·L-1， 0.093 8 μg·L-1， 0.127 4 μg·L-1， 0.127 4 μg·L-1，0.167 6 μg·L-1， 0.155 2 μg·L-1， 0.083 4 μg·L-1 and 0.321 8 μg·L-1（k=2）. The results showed that the main sources of uncertainty arose from the standard curve fitting and repeatability.

Keywords： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamides; milk; uncertainty

磺胺類药物（Sulfonamides）由于具有较广的抗菌谱以及低廉的成本，在各类养殖行业被广泛用于抑制细菌感染导致的各类疾病[1]。目前，检测磺胺类药物的常用方法是高效液相色谱-串联质谱法[2]。文中测定方法参考《牛奶中磺胺类药物残留量的测定》（农业部781号公告—12—2006）[3]，对文件规定的9种磺胺类药物进行检测。根据《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）[4]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[5]评定牛奶中9种磺胺类药物残留检测结果的不确定度并分析不确定度的影响因素。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺异噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的混合标准溶液（100 μg·mL-1，纯度均大于99.5%，北京曼哈格公司）和13C6-磺胺甲噁唑（纯度均大于99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）;甲酸、甲醇、乙腈均为色谱纯（德国默克公司）;牛奶选用磺胺类阴性备用样品。

1.2 仪器与设备

5500 QTRAP高效液相色谱-串联质谱仪（美国SCIEX公司）;KDC-140HR台式高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器公司）;BSA124S-CW电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团）。

1.3 标准溶液配制与加标样制备

乙腈溶解13C6-磺胺甲噁唑固体配制100 μg·mL-1的内标储备溶液，再用乙腈稀释得100 ng·mL-1的内标工作液。用超纯水稀释内标工作液得到12.5 ng·mL-1的内标稀释液，用内标稀释液稀释4种磺胺类混合标准液得到含有磺胺标准品浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1，内标浓度为12.5 ng·mL-1的标准溶液。将不同浓度标准溶液加入磺胺阴性牛奶中充分溶解获得加标牛奶样品，冷藏备用。

1.4 样品前处理

参照《牛奶中磺胺类药物残留量的测定》（农业部781号公告—12—2006）中的处理方法。

1.5 仪器条件

液相色谱条件：C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）;流速0.8 mL·min-1;柱温35 ℃;进样量

2 μL;流动相0.02%甲酸水+0.02%甲酸乙腈，梯度洗脱。质谱条件：电喷雾离子源正模式;扫描方式为多反应监测模式;脱溶剂气温度500 ℃;气帘气压力50 psi;雾化气压力50 psi;内标法定量。

2 结果与分析

2.1 数学模型

9种磺胺含量的计算公式为

式中：X为样品中被测物质含量，μg·L-1;，C为试液中被测物质浓度，ng·mL-1;V为试液的定容体积，mL;f为样品溶液稀释倍数;V为样品体积，mL。

2.2 不确定度来源

根据测量过程和建立的数学模型，该检测方法的不确定来源主要有：①配制标准溶液引入的不确定度;②样品量取引入的不确定度;③拟合标准曲线引入的不确定度;④重复性引入的不确定度。

2.3 不确定度的评定

2.3.1 配制标准溶液引入的相对标准不确定度ur（s）

该过程引入的不确定度由称量标准物质以及标准溶液移取体积的不确定分量组成。

称量使用电子天平由检定证书得到最大允差为0.000 3 g，假定符合均匀分布，包含因子，则有标准不确定度为u（m）=0.000 173 2 g，称取13C6-磺胺甲噁唑质量为0.01 g，其相对标准不确定度为ur（p）=u（m）/m=0.017 32。

标准溶液的配制过程见1.3描述，构成体积的不确定度分量由3个分量构成。

（1）100 mL容量瓶体积V1有体积和温度两个分量。体积提供的分量为0.01 mL，温度提供的分量为0.395 mL。故两分量的合成不确定度u（V1）=0.399 mL，由定容体积V1引入的相对标准不确定度为ur（V1）=0.003 99。

（2）1 mL移液枪体积V2只包含体积分量。由1 mL移液枪体积V2引入的相对标准不确定度为ur（V2）=0.005 774。

（3）200 μL移液枪体积V3只包含体积分量。由200 μL移液枪体积V3引入的相对不确定为ur（V3）=0.002 309 4。100 mL容量瓶使用两次，1 mL的移液枪和200 μL

移液枪各使用了8次，根据不确定度合成公式，配制标准溶液引入的相对标准不确定度ur（s）为0.025 32。

2.3.2 样品量取引入的相对标准不确定度ur（V）

样品用200 μL移液枪量取定容，其产生的不确定度有体积和重复性两个分量。

（1）体积。根据JJG 646—2006规定，200 μL移液器容量允差为±0.4%，即±0.000 8 mL，近似于矩形分布，=0.000 461 88 mL，由移液枪体积V1引入的相对标准不确定度为ur（V1）=0.002 309 4 mL。

（2）重复性。JJG 646—2006给出6次测定的RSD≤0.2%。得标准偏差S≤0.2×0.2%=0.000 4 mL。

兩分量合成不确定度为u（V）=0.002 34 mL。

因此，由样品量取定容体积V引入的相对不确定度为ur（V）=0.011 7。

2.3.3 拟合标准曲线引入的不确定度ur（curve）

校准工作曲线线性回归方程为A=B1ρ+B0，回归曲线由仪器软件计算得到。

由此样品溶液中磺胺类含量的标准不确定度计算公式为

式中：u（ρ）为样品溶液中被测组分的标准不确定度;s为校准工作曲线残余标准偏差;m为样品溶液浓度x的测量次数，为2;n为校准工作曲线的测量次数，

为6;ρ为样品溶液中被测组分浓度与内标浓度比的平均值（取2倍定量限浓度）：ρ（xz）为工作标准溶液浓度与内标浓度比的平均值，ρ（xz）=3.453;ρi为第i个校准溶液的浓度与内标浓度比，i=9;校准工作曲线引入的相对标准不确定度公式为

由上述公式计算得到的9种磺胺类药物校准工作曲线引入的不确定度计算结果分别为0.229 7、0.172 1、

0.068 1、0.084 1、0.083 0、0.109 3、0.112 3、0.049 8和0.267 4。

2.3.4 重复性实验引入的不确定度ur（rep）

对阴性样品以2倍定量限加标（加标样的理论浓度为2.50 ng·mL-1）后，加标样品6次重复测定。按正态分布计算，重复性的标准不确定度为。因此，重复性测定的相对标准不确定度为。由上述公式计算得到9种磺胺相对标准不确定度为0.023 4、0.019 1、0.009 5、0.022 7、0.026 7、0.007 9、0.009 3、0.013 1和0.030 5。

2.3.5 合成标准不确定度和扩展不确定度U

合成不确定度为，，取包含因子k=2，扩展不确定度为，由上述公式计算得到磺胺类药物的不确定度评定结果如表1所示。

3 结论

通过对高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中9种磺胺类物质含量的不确定来源进行分析，对不确定度分量进行量化和合成，当牛奶中9种磺胺类物质含量分别为21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1时，扩展不确定度分别为0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1（k=2）。在实际操作过程中应提高标准工作曲线的测定频率、增加重复次数、尽量使用混标，减少单标混合引起的误差、选择精度较高的吸量容器，从而确保标准曲线具有良好的线性和稳定性，实验数据具有良好的重复性。

参考文献

[1]张梦雪，赵义良，苏青，等.水产品中磺胺类药物残留危害及常用检测方法[J].今日畜牧兽医，2019，35（7）：79-80.

[2]李朔，张璨，马玲，等.QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法同步测定鱼肉制品中24种磺胺类抗生素[J].食品工业科技，2022，43（9）：301-308.

[3]中华人民共和国农业部.牛奶中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法[EB/OL].（2006-12-16）[2022-06-05].http：//www.agri.cn/shichang/nybz_23263/200803/t20080321_1028668.htm.

[4]国家质量监督检验检疫总局.化学分析测量不确定度评定：JJF 1135—2005[S].北京：中国计量出版社，2005.

[5]国家质量监督检验检疫总局.测量不确定度评定与表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中国标准出版社，2012.