泽泻汤抑制肝细胞铁死亡改善非酒精性脂肪性肝病的作用机制*

李二稳，高改，王梦瑶，吴丽敏，谢治深，张振强，王辉，徐江雁

河南中医药大学，河南 郑州 450046

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要表现，但无过量饮酒史的临床病理综合征[1-2]，其疾病谱包括脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌[3]。NAFLD是全球最流行的慢性肝病之一，世界范围内的发病率约为25.24%[4]，也是我国肝功能异常的首要因素，在我国发病率逐年上升，并且呈低龄化趋势[5]。目前，NAFLD的发病机制没有明确定论，多数学者认同“二次打击”及“多重打击”学说，认为该病与脂代谢紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症、内质网应激等因素有关[6]。高脂血症是指机体中脂质代谢发生紊乱，血液中的一种或多种脂质成分含量发生异常的疾病[7]，脂质在肝脏中过多堆积，则引发脂肪肝。因此，高脂血症是诱发NAFLD的主要因素[8]。现代研究认为，肝细胞和肝内巨噬细胞的铁死亡可能会促进单纯性脂肪肝变性向非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)发展[9]，因此，抑制铁死亡可能是NAFLD的一种潜在治疗手段。

中医学虽然没有明确记载非酒精性脂肪性肝病名，但对其病因病机及临床特征有所记载。中医根据NAFLD的临床特征将其归属于“痰浊”“积聚”“肥气”“胁痛”等范畴，认为NAFLD的病机以脾胃失衡、运化失司导致痰浊凝滞于肝脉为主。研究发现，NAFLD患者常见痰湿体质。因此，脾胃虚损、内生痰浊是导致NAFLD的主要原因之一[10-11]。泽泻汤出自《金匮要略》，具有健脾制水、利水除饮的功效。方中泽泻利水渗湿、泻热化浊降脂，白术健脾益气、利水燥湿，二者合用能补气健脾利湿，与NAFLD脾胃虚损、痰瘀互结的中医病机相吻合，具有非常重要的理论及临床实用价值[12]，且与已有的临床报道一致[13-14]。课题组前期研究发现，泽泻汤可通过激活肝脏激活酶B1/腺苷酸激活蛋白激酶/过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(liver kinase B1/adenosine monophosphate-activated protein kinase/peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，LKB1/AMPK/PGC-1α)通路改善NAFLD[15]，白术能激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor2，Nrf2)改善氧化应激[16]。基于此，本文拟基于Nrf2探讨泽泻汤抑制肝细胞铁死亡改善NAFLD的作用机制，以期为泽泻汤改善NAFLD提供更多的科学基础。

1 材料

1.1 动物、细胞与质粒50只SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量18～22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0003。小鼠饲养在温度(22±5) ℃，湿度(55±5)%，光照/黑暗周期为12 h/12 h的环境中，可自由摄食和饮水。所有动物实验方案均获得河南中医药大学实验动物伦理委员会批准(伦理编号：DWLL201903085)。人肝癌细胞(human hepatoma，Huh-7)、人胚肾细胞(HEK-293T)(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0120、CL-0005)接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；Nrf2-抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)质粒(美国 Promega公司，货号：177775)。

1.2 药物与试剂泽泻(安徽金芙蓉中药饮片有限公司，批号：01-20020101)；白术(浙江方药制药有限公司，批号：YPX2011021X)，经河南中医药大学付钰副教授鉴定为泽泻科植物泽泻Alismaorientalis(Sam.)Juzep.的干燥块茎和菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎。DMEM培养基(美国Corning公司，货号：10013061)；胰酶、青链霉素混合液、5×蛋白质上样缓冲液、高效放射性免疫沉淀法分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(组织/细胞)、噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)试剂、TriQuick Reagent总RNA提取试剂、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒、核蛋白提取试剂盒、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(北京索莱宝科技有限公司，货号：T1320、P1400、P1040、R0010、M8180、R1100、PC0020、R0050、D8371)；胎牛血清(美国Gibco公司，货号：42Q0682K)；特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone，t-BHQ，美国MCE公司，货号：HY-100489)；BeyoRTTMⅢ First Strand cDNA合成试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号：D7180L)；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(美国Thermo Fisher Scientific公司，货号：01090300)；PolyJet体外转染试剂(深圳恩科生物科技有限公司，货号：61758)；荧光素酶报告基因试剂盒(美国Promega公司，货号：0000312919)；小鼠Actin(C-2)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，货号：sc-8432)；兔Nrf2单克隆抗体(英国Abcam公司，货号：ab62352)；兔核纤层蛋白B1(Lamin B1)单克隆抗体(上海Abways公司，货号：P20700)；兔谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)单克隆抗体(武汉ABclonal公司，货号：A13309)；兔血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)单克隆抗体、兔铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1，FSP1)单克隆抗体、DAPI染液(武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：GB11104、GB11397、G1012)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗、HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(美国Proteintech公司，货号：SA00001-2、SA00001-1)；ROS染液(德国SIGMA公司，批号：D7008)；还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)比色法测试盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，货号：E-BC-K030-M)；丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒[硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法，南京建成生物工程研究所，货号：A003-1-2]；线粒体超氧化物红色荧光探针(中国Yeasen公司，货号：40778ES50)；氯化钠(天津市恒兴化学试剂制造有限公司，CAS号：7647-14-5)；甲醇、异丙醇、乙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，CAS号：67-56-1、67-63-0、64-17-5)；引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 仪器LightCycler®96型实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)；Eclipset S100型倒置显微镜(日本Nikon公司)；Series Ⅱ Water Jackxet型CO2细胞培养箱、5020型Arktik热循环仪、1510型全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；DHP-9082型恒温培养箱(上海安竞公司)；Microfuge 20R型冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司，离心半径：8 cm)；PowerPacTMBasic小型垂直电泳仪、Chemidoc MP型凝胶成像系统 (美国BIO-RAD公司)；FLUO star OPTIMA型多功能酶标仪(德国BMG Labtech公司)。

2 方法

2.1 泽泻汤提取物的制备按ZXT的药材组成称取泽泻150 g及白术60 g，加入8倍量的水煎煮3次，每次2 h，过滤，合并三次滤液，减压浓缩后冷冻干燥，得泽泻汤水提粉末(得率37.33%)。使用前，将泽泻汤水提粉末溶于1 mL DMSO中，配成质量浓度为250 g·L-1(以提取物粉末计)的ZXT贮备液，用0.22 μm滤膜过滤除菌，于-20 ℃保存。

2.2 动物分组、造模及给药小鼠适应性饲养2周后，随机分为空白对照组、模型组及泽泻汤低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组，其余各组均采用高脂饮食(high-fat diet，HFD，含60%脂肪和20%蛋白质)喂养建立NAFLD模型，正常组小鼠给予正常饲料喂养。模型建立的同时泽泻汤低、中、高剂量组小鼠分别以1.3 g·kg-1、2.6 g·kg-1、5.2 g·kg-1的剂量(按生药量计)灌胃给予泽泻汤提取物溶液[17]，空白对照组和模型组灌胃等体积(10 mL·kg-1)的0.5%羧甲基纤维素钠，每天1次，连续9周。

2.3 MTT法检测细胞存活率取对数生长期的Huh-7细胞，调整细胞密度为8×104mL-1，接种于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁后，将其随机分为空白组，泽泻汤不同质量浓度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1、1 g·L-1)组，每组设6个复孔。用完全培养基将ZXT溶液稀释至所需浓度，各给药组加入含相应药物的完全培养基100 μL，空白对照组加入完全培养基100 μL。培养24 h后，加入5 g·L-1的MTT 并孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，检测490 nm处的光密度(optical density,OD)值，并计算细胞存活率。

细胞存活率=(实验组OD值-空白组OD值)/(正常组OD值-空白组OD值)×100%

2.4 细胞线粒体超氧化物水平的测定取对数生长期的Huh-7细胞，调整细胞密度为4×105mL-1，接种于6孔板，每孔2 mL，随机分为空白组、模型组、t-BHQ(阳性药)组、泽泻汤组(1 g·L-1)，每组设3个复孔。培养过夜后，空白组加入2 mL完全培养基，模型组加入2 mL含0.6 mmoL 油酸(oleic acid，OA)的完全培养基，t-BHQ组加入2 mL含0.6 mmoL OA和10 μmoL t-BHQ的完全培养基，泽泻汤组加入2 mL含0.6 mmoL OA和1 g·L-1泽泻汤水提物的完全培养基，培养24 h后，按照试剂盒说明书加入1 mL探针工作液，置于37 ℃避光孵育10 min，PBS清洗后加入DIPA复染细胞核，封片后进行观察。

2.5 免疫组化法检测小鼠肝脏中 HO-1、GPX4、FSP1 的蛋白表达水平石蜡切片脱蜡脱水，切片置于柠檬酸中抗原修复，然后以PBS洗涤，再将切片放入3%过氧化氢避光孵育，之后用PBS洗涤3次，每次5 min，用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)室温封闭30 min，甩掉封闭液之后滴加 HO-1、GPX4、FSP1一抗(稀释比例1700)，4 ℃孵育过夜，滴加HRP标记的山羊抗兔二抗(稀释比例15 000)，室温孵育50 min，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，水冲洗，然后苏木素复染细胞核 1 min 左右，水冲洗，切片脱水、封片后，使用显微镜镜检，采集图像。

本着“远来都是客”和对“独在异乡为异客”的同情，不得不说，日常执法中，我们可能对于异乡人多少都会客气些，也会更有耐心：出门在外，都不容易；咱们执法工作更要将心比心，换位思考。

2.6 RT-PCR法检测相关基因的mRNA表达水平测定细胞处理方法如2.4所示。采用Trizol法提取细胞和小鼠肝脏总RNA，按照BeyoRTTMⅢ First Strand cDNA合成试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA，再按照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix试剂盒说明书，用实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应体系共10 μL，含cDNA 4 μL，SYBR Green Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反应条件为：50 ℃ 加热2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性 15 s；60 ℃ 退火1 min；72 ℃延伸30 s；共40个循环，以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 肝脏ROS水平测定肝脏冰冻切片复温，加入自发荧光淬灭剂5 min，水冲洗，滴加ROS染液，37 ℃恒温避光孵育30 min，PBS洗涤，DAPI复染细胞核，避光室温孵育10 min，脱水、封片，切片置于荧光显微镜下观察并采集图像。

2.8 小鼠肝脏MDA、GSH水平测定取一定质量的肝脏，按照肝脏质量与生理盐水19的比例加入生理盐水，匀浆，3 000 r·min-1离心10 min，收集上清，按照试剂盒说明书进行检测。

2.9Nrf2-ARE荧光素酶活性的测定取对数生长期的HEK-293T细胞，调整细胞密度为 4×105mL-1，接种于96孔板，每孔100 μL，随机分为空白组，t-BHQ(10 μmol·L-1)组，泽泻汤不同质量浓度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、0.75 g·L-1、1 g·L-1)组，每组设6个复孔。待细胞长至80%时，使用PolyJet体外转染试剂转染Nrf2-ARE质粒，每孔加入100 ng质粒，6 h后更换完全培养基，继续培养 18 h，各给药组加入含相应药物的完全培养基 100 μL，空白组加入完全培养基100 μL，培养24 h后，按照荧光素酶报告基因试剂盒说明书，弃去培养液，每孔加入报告基因裂解液100 μL，室温震荡 30 min，每孔吸取30 μL转移至白色不透明96孔板，再加入荧光素酶检测试剂，每孔50 μL，酶标仪检测荧光素酶化学发光值。

荧光素酶相对活性=给药组化学发光值/对照组化学发光值

2.10 Western Blot检测细胞内Nrf2蛋白表达量取对数生长期的Huh-7细胞，调整细胞密度为4×105mL-1，接种于6孔板，每孔2 mL，随机分为空白组，模型组，t-BHQ组，泽泻汤不同质量浓度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、1 g·L-1)组，每组设3个复孔。培养12 h后，空白组加入2 mL完全培养基，模型组加入2 mL含0.6 mmoL OA的完全培养基，t-BHQ组加入2 mL含0.6 mmoL OA和10 μmoL t-BHQ的完全培养基，泽泻汤不同质量浓度组加入2 mL含0.6 mmoL OA和不同质量浓度泽泻汤水提物的完全培养基，培养24 h后，按照核蛋白提取试剂盒说明书，加入浆蛋白抽提试剂，冰上裂解10 min，4 ℃条件下15 000 r·min-1离心15 min，上清即为浆蛋白。向沉淀中加入核蛋白抽提试剂，冰上裂解 10 min，4 ℃条件下15 000 r·min-1离心15 min，上清即为核蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，变性蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dadecyl sulfate palyacrylaniongel electroptoreis,SDS-PAGE)后分离，转膜，用5%脱脂奶粉封闭，加入Nrf2、β-actin、Lamin B1一抗(稀释比例11 000)，置于4 ℃过夜，用Tris缓冲盐溶液+吐温(tris-buffered saline with tween，TBST)洗涤4次，每次10 min，加入相对应的二抗(稀释比例110 000)，室温振摇孵育2 h，TBST洗涤4次，每次10 min，加入ECL化学发光显影液，经凝胶成像系统曝光成像。使用Image J 1.8.0软件对条带的灰度值进行统计，以目的蛋白条带和β-actin条带的灰度值比值，作为胞浆目的蛋白的表达量；以目的蛋白条带和Lamin B1条带的灰度值比值，作为胞核目的蛋白的表达量。

3 结果

3.2 ZXT改善OA诱导的Huh-7细胞铁死亡OA是一种单不饱和脂肪酸，在体外引起脂质蓄积，造成脂肪变性，是NAFLD常用的造模方法[20]。长链酯酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)是铁死亡最关键的因子之一，催化合成CoA，用于合成铁死亡需要的多不饱和脂肪酸，进而促进铁死亡[21]。与空白组比较，模型组CoQ10mRNA水平显著下降(P<0.001)，ACSL4mRNA水平显著升高(P<0.001)；与模型组比较，ZXT干预可显著提高FSP1mRNA、CoQ10mRNA的水平(P<0.05)，显著降低ACSL4mRNA的水平(P<0.001)。以上结果表明，ZXT可在体外抑制肝细胞铁死亡。见图2。

注：A：Huh-7细胞中FSP1 mRNA的表达水平；B：Huh-7细胞中CoQ10 mRNA的表达水平；C：Huh-7细胞中ACSL4 mRNA的表达水平；n=6；与空白组相比，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，###P<0.001

3.3 ZXT改善NAFLD小鼠肝脏氧化应激脂质过氧化是引起细胞铁死亡的关键因素，而MDA是脂质过氧化的代谢终产物，是氧化应激的标志物之一，且氧化应激会诱导细胞内GSH耗竭。与空白组比较，高脂饮食诱导后，模型组小鼠肝脏ROS、MDA水平显著增加(P<0.001)，HO-1、GPX4、GSH的水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，ZXT可显著降低ROS、MDA水平(P<0.05)，显著升高 HO-1、GPX4、GSH的水平(P<0.001)。以上结果表明，ZXT能改善NALFD小鼠肝脏氧化应激。见图3。

注：A：肝脏ROS染色图(×400)，n=3；B：肝脏HO-1、GPX4免疫组化图(×400)，n=3；C：A的量化图；D-E：B的量化图；F-G：肝脏MDA、GSH含量，n=6；与空白组相比，*P<0.05,***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

3.4 ZXT改善OA诱导的Huh-7细胞氧化应激与空白组比较，模型组线粒体MitoSOX水平显著上调(P<0.001)；与模型组比较，ZXT干预后线粒体MitoSOX水平显著下调(P<0.001)。结果表明，ZXT可在体外改善氧化应激。见图4。

注：A：Huh-7细胞线粒体超氧化物染色图；B：A的量化图，n=3；与空白组相比，***P<0.001；与模型组相比，###P<0.001；比例尺：200 μm

3.5 ZXT激活Nrf2并促进其靶基因的表达为研究ZXT改善氧化应激的作用机制，使用荧光素酶报告基因法检测ZXT对Nrf2-ARE荧光素酶活性的影响，Nrf2是核转录因子，进入细胞核后会发挥抗氧化能力。与空白组比较，ZXT剂量依赖性提升Nrf2-ARE的转录活性。与空白组比较，模型组Nrf2mRNA的表达量显著降低(P<0.001)；与模型组比较，ZXT可显著增加Nrf2及其下游抗氧化基因GPX4、GSS、UGT、GST的mRNA表达量(P<0.05)，剂量依赖性上调Nrf2核蛋白表达量。以上结果表明，ZXT可在体外激活Nrf2改善氧化应激。见图5。

注：A：Huh-7细胞活力检测，n=6；B：Nrf2-ARE荧光素酶活力检测，n=6；C-H：Nrf2及其下游基因mRNA相对表达量检测，n=6；I：Huh-7细胞胞浆及核Nrf2蛋白检测，n=3；J-K：I图的量化，n=3；与空白组相比，*P<0.05，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

3.6 ZXT促进NAFLD小鼠肝脏Nrf2下游靶基因表达与空白组比较，模型组小鼠肝脏中HO-1mRNA、GPX4mRNA、GSSmRNA、GCLmRNA的相对表达量显著降低(P<0.001)；与模型组比较，给予ZXT治疗后，小鼠肝脏中Nrf2下游靶基因HO-1mRNA、GPX4mRNA、GSSmRNA、GCLmRNA、UGTmRNA的表达量显著增加(P<0.05)。以上结果表明，ZXT在体内也可激活Nrf2改善氧化应激。见图6。

注：A-E：小鼠肝脏Nrf2下游基因mRNA相对表达量检测；与空白组相比，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，###P<0.001

4 讨论

铁死亡是一种铁依赖性的脂质过氧化物积聚造成的细胞死亡，其实质是细胞内铁超载导致的ROS大量蓄积，细胞膜发生脂质过氧化反应，并最终造成细胞死亡。近年来研究表明，脂质过氧化、铁超载、氧化应激等均是NAFLD发生发展的关键因素。铁死亡细胞中的脂质过氧化产物会促进NASH的发生发展[22-24]。NASH模型小鼠中有铁死亡发生，铁死亡抑制剂治疗后，小鼠肝脏脂质蓄积明显减少[25]。因此，改善氧化应激、抑制铁死亡可能是治疗NAFLD的治疗策略之一。

泽泻汤由白术、泽泻两味中药组成，具有药简效佳的特点，方中泽泻甘、淡、利水渗湿为君药，白术甘、苦、健脾燥湿为臣药，二者相须使用，共奏健脾利湿泄浊之效。现代研究表明，泽泻汤具有降血脂、改善体内代谢异常的作用[26-31]。

脾主运化功能在机体脂质代谢中具有重要作用。脾失健运就会形成湿浊、痰凝，进而导致脂质代谢发生紊乱。而高脂血症是诱发NAFLD的关键因素，痰湿脾困是高脂血症发生的主要病机，临床上常用健脾、燥湿、祛痰等方法进行治疗。在高脂饮食喂养或者OA诱导后，细胞内积聚大量的游离脂肪酸，脂代谢紊乱，脂质过氧化加剧，导致铁死亡发生，与中医认为脾主运化水谷相吻合。因此，脂质过氧化引起的肝细胞铁死亡可能是痰湿脾困的现代分子学基础之一。

铁死亡具有独特的生化特征，如胞内铁离子的积聚、ROS升高以及脂质过氧化、GSH的耗竭、GPX4的减少等。GPX4是铁死亡的重要调节因子，可通过GSH减少脂质的蓄积，继而阻止铁死亡的发生[32]。脂质过氧化物的过度蓄积也是铁死亡的一大特征[33]，MDA是脂质过氧化产物之一，会影响脂肪酸的氧化分解，进一步加剧肝细胞的氧化应激状态[34]。本研究结果显示，ZXT可上调NAFLD小鼠肝脏FSP1、CoQ10、GPX4、GSH水平，降低MDA、ROS含量，还能逆转OA诱导的Hun-7细胞中FSP1mRNA、CoQ10mRNA、GPX4mRNA水平的降低，促进ACSL4mRNA表达，减少线粒体超氧化物含量，提示ZXT可抑制肝细胞铁死亡。由此推测，泽泻汤可通过改善氧化应激抑制铁死亡发生，进而发挥改善NAFLD的作用。

正常情况下，Nrf2在细胞质中与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1)结合，不能入核发挥转录活性，一旦受到外界活性氧等刺激，Nrf2可从Keap1上解离出来，进入细胞核，与细胞核启动原件ARE相结合，启动下游抗氧化基因的转录，如HO-1、GPX4等，进而发挥抗氧化作用，减轻氧化损伤[35]，抑制铁死亡[36]。目前认为，Nrf2可能是治疗代谢性疾病如肥胖、NAFLD、糖尿病等的关键潜在靶点[37-38]。本研究结果显示，ZXT能显著上调Nrf2的转录活性，升高Nrf2表达，提示ZXT可能通过激活Nrf2抗氧化抑制肝细胞铁死亡。

综上所述，ZXT可抑制肝细胞铁死亡改善NAFLD，其作用可能与激活Nrf2通路有关。本研究为泽泻汤改善NAFLD提供了新的思路和方法，但还需要进行更深入的机制研究。