水剂法提取油茶籽油形成的乳化液中蛋白的分离及其结构表征

杨建远，周 凯，杨义文，杨云仙，张炳火，查代明，邓泽元

(1.九江学院 药学与生命科学学院，江西 九江 332000； 2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室， 南昌330047； 3.九江学院 旅游与地理学院，江西 九江 332005)

水剂法是一种“安全、营养、经济”的提油方法，具有工艺简单、条件温和、营养伴随物基本得以保留及可有效利用饼粕等优点[1]。然而，乳化问题是制约水剂法提取油茶籽油工业化应用的“瓶颈”[2]，并且水剂法提取油茶籽油时产生的乳化液难以在提油工艺中有效破乳[3]。

蛋白是一种双亲性大分子，易吸附于油水界面，通常具有一定的界面活性和胶体稳定性，被广泛用作乳化剂和稳定剂。研究表明，大多数油料种子蛋白具有乳化特性，如从大豆[4]、葵花籽[5]、油莎豆[6]等提取的蛋白都具有较好的乳化活性。然而，蛋白乳化性的强弱很大程度上取决于其氨基酸组成、疏水性和二级结构等结构特性[7]。豆类蛋白二级结构中β-折叠含量高于谷类蛋白，而α-螺旋含量低于谷类蛋白，豆类蛋白乳化性及乳化稳定性强于谷类蛋白[8]。大豆-乳清混合蛋白(SPI-WPI)经超声处理可使其二级结构及构象发生一定的改变，导致其α-螺旋含量降低，β-转角含量增加，分子结构更加舒展，疏水基团暴露，乳化活性提高[9]。紫苏籽球蛋白、清蛋白和分离蛋白中氨基酸含量以谷氨酸最高，蛋白溶解性以球蛋白最好[10]。因此，不同蛋白乳化能力的差异取决于蛋白自身结构[11]。

蛋白、茶皂素和多糖等可能是水剂法提取油茶籽油过程中产生的乳化液中的主要乳化剂成分，其中蛋白含量占脱脂冻干乳化物的13.75%[12]。从油茶籽饼粕中提取的蛋白具有较好的起泡性和乳化性，而且经不同的蛋白酶水解处理，其起泡性和乳化性可得以改善[13]。本文对水剂法提取油茶籽油过程中形成的乳化液的主要蛋白组分进行分离纯化，探讨与乳化相关的结构特征，旨在阐明水剂法提取油茶籽油时乳化液形成机制及为其破乳提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

油茶籽，江西绿源油脂公司。DEAE-Sepharose Fast Flow柱，GE Healthcare Bioscience；考马斯亮蓝R250，上海化学试剂公司；SDS-PAGE试剂盒，碧云天生物公司；8-苯胺-1-萘磺酸钠(ANS)，阿拉丁试剂公司。

F97Pro荧光光度计，上海棱光公司；S-433d氨基酸分析仪，Sykam公司；Nicolet 5700傅里叶变换-红外光谱仪，美国热电公司；K1100全自动定氮仪，海能科技公司；Ultra Turrax T18高速分散机, 美国IKA公司；JMS-50胶体磨，廊坊通用机械公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳化液中粗蛋白的提取[14]

油茶籽经干燥、剥壳、粉碎及过筛处理，加4倍量的蒸馏水混匀，经胶体磨匀浆，静置待上层泡沫消失后，以4 200 r/min离心20 min，收集乳化液层。反复冻融离心去除乳化液中油脂，将残渣冻干，经乙醚浸泡后过滤脱脂2～3次，获得脱脂乳化物。

称取一定量的脱脂乳化物于锥形瓶中，按料液比1∶20加入90%乙醇溶液，30℃水浴120 r/min下振荡30 min，以4 200 r/min离心20 min，取沉淀，提取2次。再以初始样品质量为基准，按料液比1∶30加入pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液，37℃摇床水浴60 min，离心，收集上清，沉淀重提1次，合并上清得蛋白粗提液。调pH至4.0，4℃冰箱静置2 h，离心收集沉淀，取少量蒸馏水洗涤2次，超纯水溶解，调pH至7.0，冻干，得粗蛋白。

1.2.2 粗蛋白乳化性的测定

1.2.2.1 乳液的制备[14]

采用pH 7.0的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液配制1%的粗蛋白溶液(含0.02%的叠氮钠)。分别取24 mL粗蛋白溶液，用0.5 mol/L HCl或NaOH调节pH 分别至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，用高速分散机于14 000 r/min下慢慢加入一定质量的油茶籽油，使油茶籽油质量分数为20%，当油茶籽油完全被乳化后，以11 000 r/min 的速度分散2 min，再经简单乳化装置(专利号：ZL201620355811.8)均质10次，得乳液。

1.2.2.2 乳液稳定性及微观结构的观察

分别取8.0 mL乳液分装于比色管中，静置观察10 d后，取少量分散乳液用相应pH的缓冲液稀释50倍，取50 μL稀释乳液于凹槽载玻片上，盖上盖玻片，用荧光倒置显微镜观察微观结构，并拍照。

1.2.3 粗蛋白的初步纯化

用pH 8.0 的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液配制20 mg/mL的粗蛋白溶液，并上样吸附于DEAE-Sepharose Fast Flow柱，分别用含0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L NaCl的pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液分步洗脱，以每管8 mL自动收集洗脱液，采用Bradford法测定洗脱液中蛋白峰，收集合并蛋白峰，并用10 kDa超滤膜浓缩，冻干，获得初步纯化的蛋白组分(PEP)，采用凯氏定氮法测定PEP中蛋白质含量。

1.2.4 SDS-PAGE分析

参照文献[15]和SDS-PAGE试剂盒进行SDS-PAGE分析。

1.2.5 氨基酸含量分析

参考Yin等[16]的方法略作修改。称取20～30 mg PEP样品于安瓿管，加10 mL 6 mol/L HCl溶液、1.0 g苯酚，通氮气，110℃水解24 h，冷却定容，取适量水解样品水浴挥干，用1.0 mL 0.1 mol/L HCl(pH 2.2)溶解，过0.22 μm滤膜，待氨基酸分析仪分析。

1.2.6 内源荧光强度(FI)的测定[17]

称取PEP样品溶于pH 7.0的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液中，使PEP质量浓度为100 μg/mL，采用荧光光度计测定其FI。测定条件：狭缝宽度10 nm，激发波长280 nm，发射波长295～400 nm。

1.2.7 表面疏水性(S0)的测定[18]

用pH 7.0的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液配制PEP质量浓度分别为0.50、0.25、0.13、0.03 mg/mL的样品溶液，分别取3 mL样品溶液，各加入20 μL 8.0 mmol/L ANS溶液，搅匀，暗处静置15 min后，室温下采用荧光光度计测定其荧光强度。测定条件：激发波长和发射波长分别为390、470 nm，狭缝宽度10 nm。样品质量浓度与荧光强度直线方程的斜率即为S0。

1.2.8 二级结构分析

采用傅里叶变换-红外光谱(FTIR)预测蛋白二级结构，PEP样品处理参照Kang等[19]的方法。样品蛋白冻干粉用KBr粉高压制样，扫描范围4 000～400 cm-1。酰胺I带光谱(1 600～1 700 cm-1)段内蛋白利用Omnic和PeakFit软件分析二级结构。

1.2.9 数据分析

利用Origin 8.0 软件作图，数据以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 粗蛋白乳化性的初步观察

按1.2.2.1方法制备乳液，发现不同pH条件均能形成包油量为20%的乳液且不同pH条件下的乳液随着观察时间的延长，均出现向上漂浮的现象，这可能是乳化包油量较大均质不充分所致。静置10 d后，pH 12.0的乳液出现部分乳粒破乳现象，其乳液上层可见少量油析出。

显微镜下观察静置10 d的乳液微观结构，发现pH 2.0、4.0、6.0、8.0和10.0的乳液均为较稳定的大小不均一的乳液粒子，仅有pH 12.0的乳液出现油粒(见图1)。

因此，从乳化液中提取的粗蛋白在pH 2.0～10.0范围条件下均具有较强的乳化活性和乳化稳定性。pH的变化可能改变了溶液中蛋白质的构象，导致其亲水性基团(水结合位点)的暴露或包埋，从而改变其亲水亲脂平衡[20]。当pH增加至12.0时，很可能由于蛋白质氨基酸基团的离子化，其亲水性增加，从而亲水亲脂平衡被改变，蛋白在油水界面的亲油能力减弱，导致乳粒的包油稳定能力下降。因此，pH 12.0条件下的乳液长时间储存后出现了油析现象。

注：目镜10倍，物镜40倍，标尺10 μm。

将1.2.1提取的粗蛋白按1.2.3方法采用pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，上DEAE-Sepharose Fast Flow 柱吸附，经不同NaCl含量的Tris-HCl缓冲液洗脱，发现在含0.6 mol/L NaCl的pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱时获得PEP洗脱峰，测得其蛋白质含量为(84.78±5.57)%。

2.3 SDS-PAGE分析

PEP的SDS-PAGE分析结果见图2。由图2可知，PEP中的蛋白质分子质量集中于10～35 kDa之间，主要为13、15、16、17、21、25 kDa和35 kDa 7个蛋白条带，其中分子质量13 kDa蛋白的含量最高。

图2 PEP 的SDS-PAGE图谱

2.4 氨基酸组成

PEP的氨基酸组成及含量测定结果见表1。

表1 PEP的氨基酸组成及含量

由表1可知：PEP中酸性、碱性、不带电荷的极性氨基酸和非极性氨基酸含量分别为(48.10±0.11)%、(21.27±0.04)%、(11.62±0.05)%和(19.00±0.05)%。其中，谷氨酸含量高达(40.36±0.14)%，精氨酸含量和天冬氨酸含量分别为(14.51±0.09)%和(7.74±0.03)%。

2.5 内源荧光强度和表面疏水性

蛋白溶液的内源荧光强弱能体现蛋白分子表面疏水基团的信息，通常用于蛋白构象特征的表征[21]。PEP内源荧光强度分析结果如图3所示。由图3可知，PEP的最大荧光强度(Fmax)为674.1，高于菜籽蛋白中乳化性白蛋白、球蛋白和分离蛋白在pH 4.0～9.0间的Fmax值(7.9～62.1)[22]。这是由于PEP表面的疏水基团易于引起蛋白之间更好的交互作用，能更容易在油水界面上形成分子排布的保护性层[23]。

图3 PEP内源荧光强度(FI)光谱图

S0体现蛋白分散吸附于油水界面能力[24]。经测定，PEP的S0值为2 243.70±169.28(R2=0.982)，稍高于木通子中的白蛋白与谷蛋白[25]。可见，PEP较高的表面疏水性有利于蛋白的乳化活性和乳化稳定性。

2.6 二级结构的预测

PEP的傅里叶变换-红外光谱图如图4所示。

图4 PEP的傅里叶变换-红外光谱图

3 讨 论

3.1 乳化液中蛋白的乳化性

从水剂法提取油茶籽油过程中形成的乳化液中分离得到的粗蛋白乳化活性很强，仅以高速分散机简单均质便可在pH 2.0～12.0条件下形成包油量达20%的水包油型乳液，室温下储存10 d仅见pH 12.0条件下形成的乳液出现油析现象，这可能是蛋白在强碱性条件下乳化能力减弱，形成的乳粒表面蛋白保护层难以长时间维持高达20%的包油量所致。

3.2 乳化液中蛋白的结构特性

3.2.1 乳化液中蛋白的组成

粗蛋白经DEAE-Sepharose Fast Flow柱初步纯化时，含0.6 mol/L NaCl的pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱时获得唯一主要蛋白洗脱峰，PEP为完整的纯化乳化蛋白组分，SDS-PAGE分析表明，PEP主要为含有7个分子质量的蛋白条带的混合蛋白，分子质量范围为10～35 kDa。油体蛋白具有双亲性分子结构，在油水两相存在的混合物中容易发生乳化，是广泛存在于植物种子中的一种天然乳化性蛋白[28]。多数含油种子中乳化性油体蛋白多为分子质量较小的亚型，如：大豆有1种16 kDa，3种18 kDa，3种24 kDa的油体蛋白亚型[29]；花生有14、16、18 kDa 3种油体蛋白亚型[30]；油茶籽有5种油体蛋白亚型，包括3种高分子(H)亚型(OleⅠ、OleⅣ和OleⅤ)，2种低分子(L)亚型(OleⅡ和OleⅢ)[31]。PEP中的几个分子质量相近的蛋白条带是否为油茶籽中主要乳化性的油体蛋白相关亚型值得进一步鉴定。

3.2.2 乳化性蛋白的结构特征

PEP中二级结构含量高低顺序为β-折叠、α-螺旋、无规卷曲和β-转角。蛋白二级结构与表面疏水性具有相关性，Chen等[27]报道大豆蛋白表面疏水性与α-螺旋含量呈负相关，与β-折叠和无规卷曲呈正相关。PEP中β-折叠含量达31.55%，谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量高，其溶液最大荧光强度为674.1，S0值高达2 243.70±169.28。可见，PEP中二级结构、氨基酸组成等有利于蛋白表面疏水性及其乳化特性。

4 结 论

水剂法提取油茶籽油形成的乳化液中乳化性粗蛋白组分经高速分散与均质，在不同pH条件下均能形成包油量达20%的乳液。经初步纯化后得到的蛋白组分PEP包括7个主要蛋白条带的混合蛋白，分子质量范围为10～35 kDa，其中分子质量13 kDa蛋白的含量最高。PEP具有较多的有利于乳化的结构特征，如：蛋白二级结构中β-折叠、无规卷曲含量相对较高，氨基酸组成中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量高，同时，蛋白溶液具有较高的内源荧光强度和表面疏水性结构特征。推测蛋白组分PEP为水剂法提取油茶籽油过程中乳化液形成的重要因素之一。