饲粮中添加海藻对山羊瘤胃微生物多样性的影响

代邦国，耿亚楠，翁玉楠，史怀平

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

海藻作为饲料添加剂的一种，含有氨基酸、脂肪酸、藻多糖、维生素等多种高价值的营养成分。但目前海藻饲料的研究主要集中在其对动物生长发育和生产性能的研究，本实验室先前的研究表明，添加3%的海藻不会影响山羊的生长性能、屠宰性能和肌肉品质，但有改善血脂指标以及肌肉与脂肪组织脂肪酸组成的潜力。山羊瘤胃作为一个厌氧的消化系统，瘤胃中的微生物，包括细菌、真菌、古菌和病毒等共同组成了复杂的微生物共生群落，良好的瘤胃菌群环境能提高反刍动物饲料转换和营养吸收效率。瘤胃中微生物的多样性对瘤胃的发育至关重要，不仅可以帮助宿主将难以消化的纤维素和半纤维素等物质分解成微生物蛋白以及挥发性脂肪酸(VFA)，同时在维持宿主消化道稳态及免疫健康等方面也发挥着重要作用。本试验旨在探究饲粮中添加海藻对山羊瘤胃内菌群结构的影响，为海藻饲料的应用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验于2017年8-11月在西北农林科技大学萨能奶山羊原种场进行。选择16只6月龄的西农萨能奶山羊青年公羔(21.9±0.98 kg)。采用单因素随机试验设计，随机分为对照组(C)和试验组(A)，每组4个重复，每个重复2只公羔在一个圈内。对照组羔羊饲喂TMR基础日粮，试验组羔羊饲喂TMR基础日粮+3%海藻(Schizochytrium sp.，粗脂肪(EE)≥ 60%, DHA ≥ 12%; 天津奥特奇生物制品有限公司)。试验期共89d，其中预饲期5d，正饲期12周。每日8：00和16：00饲喂2次，自由饮水。基础饲粮组成和营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 瘤胃液样品采集

试验最后一天早晨7：30从每个重复内随机选择一只羔羊，即每组4只，共8只羔羊，通过真空泵采集瘤胃液。每只羊采集50 mL，迅速测定pH后，经4层消毒纱布过滤，将滤液4 000 r/min离心15 min后取5 mL瘤胃液液氮速冻，之后送至上海美吉生物医药科技有限责任公司。

1.3 DNA 抽提、PCR 扩增和荧光定量

1.4 Miseq文库构建和测序

通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端，使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，送上海美吉生物医药科技有限公司进行Miseq测序。

1.5 生物信息分析及统计处理

利用上海美吉生物医药科技有限公司提供的生信Usearch分析平台对Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，使用RDP分类器classifier tool(http://rdp.cme.msu.edu/)对16s序列进行物种分类注释，最低分类到种水平，使用 Silva 数据库(SSU123)比对，置信度阈值设置为 0.7。试验数据采用Excel 2010进行初步整理，结果用 x±s表示，P<0.05表示差异显著。利用R语言工具制作曲线图。

2 结果与分析

2.1 瘤胃微生物多样性

2.1.1 瘤胃微生物测序深度和OTU分析 试验8个样品共得到406 316条原始序列，平均每个样品50 790±5 529条。对序列进行优化后按照97%相似度对序列进行OTU聚类，其中有效序列278 740条，共聚类得到1 236条OTU。对OTU序列进行物种注释发现OTU序列共覆盖20个门，41个纲，77个目，126个科，264个属及447个种的细菌。对OUT序列进行门水平核心物种分析(图1A)，发现样本量>4时，核心菌门为12，核心菌门不再随样本量增加而增加，表明测序样本量充足(图1B)。由稀释性曲线图可以看出，各样本稀释曲线均趋于平缓。当原始序列数>20000时，得到的物种数量增加趋势缓慢，说明在原始序列数>20000的测序深度条件下，测序结果可以覆盖绝大多数的瘤胃微生物。同时在测序深度相同时，对照组相比于试验组可以覆盖到更多的微生物。

图1 Sobs曲线(a)和核心物种曲线(b)

2.1.2 瘤胃微生物群落α多样性分析 α 多样性分析是用来反映微生物群落的丰富度和多样性，并可通过一系列的统计分析指标对环境群落的物种丰富度和多样性进行估计分析。由表3可知，在瘤胃微生物群落α多样性分析中，群落丰富度指数chao 1、ace海藻添加组显著小于对照组(<0.05)，表明海藻添加组瘤胃微生物群落丰富度显著低于对照组；群落多样性指数Simpsen、shannon和群落均匀度指数shannoneven两组差异不显著(>0.05)，群落覆盖度指数Coverage指数两组均大于99%。

表2 饲粮中添加海藻对西农萨能奶山羊公羔瘤胃微生物α多样性指数的影响

2.2 瘤胃微生物物种组成分析

图2为门水平上两组共有微生物群落分布图。占菌群种类总数1%以上的有拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、螺旋体门(Spirochaetes)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)等，分别占菌群总数的54.03%、37.44%、1.88%、1.58%、1.4%和1.0%。其中拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)占菌群总数的91%以上，是瘤胃中最重要的菌门。

图2 门水平上两组共有微生物群落分布图

2.3 瘤胃微生物比较分析

图3a中Stress<0.05，表明该NMSD结果有很好的代表性。A组和C组的各自的4个样本点互相接近，且通过分组椭圆可以将两组样本清晰的分开，分组椭圆无交叉。图3b中两组样本OTU水平聚类效果明显。均表明两组组内样本组成相似，样本间差异明显。

图3 瘤胃微生物比较分析

在门水平上，由图4a可以看出添加海藻的试验组纤维杆菌门(Fibrobaceters)和螺旋体菌门(Saccharibacteria)相对丰度显著低于对照组(<0.05)，其余菌门差异均不显著(>0.05)。在属水平上，由图4b可以看出添加海藻的试验组未知属型拟杆菌BS11(norank_f__Bacteroidales_BS11_gut_group)、纤维杆菌属(Fibrobacter)和瘤胃球菌属_NK4A214(Ruminococcaceae_NK4A214_group)相对丰度显著低于对照组(<0.05)。

图4 门水平(a)和属水平(b)上的物种差异分析

3 讨 论

青年羊瘤胃占全胃的比例在60%左右，饲粮对瘤胃内发酵主要是通过影响瘤胃菌群区系或功能来实现。肠道中的厚壁菌门和拟杆菌门有利于动物消化植物来源的食物，较高含量的厚壁菌门和拟杆菌门是植食性动物肠道微生物群落的典型特征。曾燕等报道蒙古羊瘤胃中主要优势菌群为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。索效军等报道的湖北黑头羊中拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)占菌群总数的90%以上。本研究发现，奶山羊瘤胃中拟杆菌门(Bacteroidetes,54.03%)和厚壁菌门(Firmicutes,37.44%)占菌群总数的91%以上，与上述结果一致，表明饲粮中添加海藻不会改变山羊瘤胃中的主要优势菌门。

海藻中富含多糖类、多酚类等生物活性物质，具有较好的抗氧化活性和抗菌活性，能有效抑制和清除动物体内活性氧自由基。抑菌相关试验表明藻类中的一些成分可以减少细菌、原生动物、古细菌、真菌的复杂瘤胃微生物群。白建等选取1日龄体重相近的AA肉鸡，发现添加海藻粉和抗菌肽降低了21和42日龄肉鸡盲肠大肠杆菌的数量。Leonard 等研究发现添加海藻提取物后仔猪结肠大肠杆菌种群和肠杆菌科数量显著减少，结肠中具有更高水平的黏蛋白 MUC2 m RNA 丰度。本试验在山羊饲粮中添加3%海藻，瘤胃中纤维杆菌门(Fibrobaceters)和螺旋体菌门(Saccharibacteria)丰富度指数chao 1和ace显著降低，与上述结果一致，表明添加海藻降低了山羊瘤胃微生物群落的丰富度，可能原因是海藻中多糖和多酚等物质的抑菌作用引起的。

瘤胃球菌属是消化球菌科(Peptoeaccaeeae)的革兰氏阳性厌氧细菌，其下的两个种白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和属于纤维杆菌门的产琥珀酸丝状杆菌是现今公认的瘤胃三大优势纤维分解菌。白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌均能产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，是降解木聚糖主要的细菌。产琥珀酸丝状杆菌能产生高水平的内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，是降解重钙化纤维素，如棉花粗纤维素的重要细菌。Zeng等在山羊日粮中添加烷基多糖苷后改变了瘤胃细胞膜上的脂肪酸组成，降低了白色瘤胃球菌的数量。这与本试验添加海藻后瘤胃球菌属_NK4A214(_NK4A214_group)显著下降的结果一致，推测可能原因是由于海藻中一些多糖类作用引起的。李旦等发现在肉牛瘤胃日粮中添加4%的豆油和胡麻油可以显著减少瘤胃中纤维分解菌，表明饲粮中植物油脂中某些脂肪酸可能对纤维分解菌有抑制作用。孙云章等研究表明，随着精料比例的增大, 瘤胃真菌数量逐渐降低直到消失, 细菌数量逐渐上升，当精料增加到一定水平时，瘤胃内的低 pH 环境最终会抑制纤维降解菌的生长。柳君辉等发现，高精料模式下肉牛瘤胃中门水平上的纤维杆菌数量下降。本试验结果表明，基础日粮中添加3%海藻可以显著降低山羊未知属型拟杆菌BS1(norank_f___BS11_gut_group)、纤维杆菌属()，可能原因是海藻中丰富的脂肪酸等营养物质抑制了山羊瘤胃中的纤维素降解菌的数量。层级聚类和NMSD分析结果发现，可通过比较瘤胃微生物进而区分试验组与对照组，试验组又以某种新的相似性而独自聚合，表明饲粮中添加海藻可以显著影响山羊瘤胃微生物的结构，使其具有新的群落特点。综上所述，添加海藻对山羊瘤胃微生物区系具有显著的影响，更深入的原因还有待进一步研究。

4 结 论

饲粮中添加海藻显著影响青年山羊瘤胃群落结构，降低瘤胃微生物群落丰富度，降低了瘤胃中纤维杆菌和瘤胃球菌等主要纤维降解菌的相对丰度。