不同海拔牦牛胎儿组织中HIF-1α基因表达特点研究

周 娟，万瑞东，李 凤，王欣玥，秦鸿楠，陈勇豪，方莉莉，张勤文

(青海大学 农牧学院动物医学系，青海 西宁 810016)

牦牛是高原土著动物，生活在海拔3 000 m以上的高山草甸。由于长期受到低氧等高原特殊气候因子的影响，牦牛在各水平层次均已获得稳定的低氧适应特征。近年来，许多学者从组织学及分子生物学方面研究牦牛在缺氧条件下组织器官水平对环境的适应性。而一些学者认为，牦牛能在低氧寒冷的环境中生存主要是与一些低氧适应性的相关基因有关，而并非仅靠组织器官发挥作用。

低氧诱导因子-1(HIF-1)调控许多与低氧反应相关的基因，由α、β两个亚基构成异二聚体，其中HIF-1β亚基在常氧和低氧环境中均能以组成型结构表达，而HIF-1α亚基仅在缺氧环境下表达于细胞核中，决定HIF-1的活性，因此机体内HIF-1α的表达对缺氧适应起重要作用。在常氧下，HIF-1α的氧依赖降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)，ODDD上特异的脯氨酸残基(Pro402和Pro564)可以被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)结合并发生羟化反应，导致HIF-1α蛋白复合体在常氧下降解，半衰期很短很难在常氧下检测其表达。而在缺氧环境中，PHD丧失活性，无法进行羟基化反应，HIF-1α激活低氧相关靶基因的转录位点，从而增加氧气的利用并促进机体新陈代谢，在缺氧条件下会稳定表达，并且通过调控下游基因的转录和表达发挥特定生物学功能。

目前关于牦牛胎儿低氧适应中HIF-1α作用的分子调控机制的研究相对较少，本试验研究牦牛胎儿不同组织-1基因，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹(Western-blot)技术，对不同海拔高度牦牛胎儿组织中的表达情况进行分析，以期对牦牛低氧适应分子机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 动物及处理

从青海省海晏县(海拔3 200 m，以下简称“海晏牦牛”)和青海省泽库县(海拔3 700 m，以下简称“泽库牦牛”)选择临床健康的怀孕16周左右的牦牛各3头，颈动脉放血处死，迅速解剖并取牦牛胎儿的脑组织、心肌、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌等器官或组织，置液氮中保存备用。

1.2 引物的设计与合成

于GenBank查询牦牛()-1基因(XM_005890693.1)序列及内参基因-(XM_005887322.2)序列，利用Oligo7软件设计特异性引物(引物信息序列见表1)，并交由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1 高原牦牛HIF-1α基因引物序列

1.3 总RNA提取和cDNA第一条链的合成

按照总RNA提取试剂盒说明书提取牦牛各组织中总RNA，使用核酸蛋白检测仪测定浓度后，取2 μg OD/OD介于1.8～2.0之间的RNA样品，用1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。按照反转录试剂盒说明书反转录出cDNA的第一条链，置-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR

为比较各组-1mRNA转录水平，采用实时荧光定量PCR方法检测其相对表达量。实时荧光定量PCR扩增体系(总体积为20 μL)：cDNA 2 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，TB Green Premix Ex Taq II酶10 μL，ddHO 6.8 μL。以-为内参，目的和内参分别设3个平行。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s。采用相对ΔΔCt法(2)对-1mRNA在牦牛胎儿组织中的转录水平进行分析。同海拔不同组织mRNA转录水平标准化到脑组织结果中；不同海拔牦牛mRNA转录水平标准化到海晏牦牛中。

1.5 蛋白提取及Western-blot分析

用蛋白提取试剂盒提取总蛋白，蛋白质浓度通过BCA法测定，4×蛋白上样缓冲液对蛋白进行变性；取40 μg变性后的蛋白上样，经过SDS-PAGE 电泳(5%浓缩胶，8%分离胶)跑胶，电泳停止后采用湿转法转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭3 h，4 ℃一抗孵育16 h，1×TBST洗涤5次(10 min/次)；25 ℃二抗孵育2 h，1×TBST洗涤10次(10 min/次)；取ECL发光液，按说明书步骤充分混合后，在自动蛋白曝光仪曝光，待条带清晰呈现，拍照。使用AlphaView软件测得光密度值对目的蛋白条带进行量化，每个样品做3次重复。-作为内参，通过划分目标蛋白平均灰度值将其标准化。

1.6 数据的统计分析

通过SPSS软件进行单因素方差分析，用“平均值±标准误”来表示qRT-PCR和Western-blot结果。<0.05表示差异显著，>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 组织总RNA提取

随机选取OD/OD值介于1.8～2.0的各组织总RNA 进行1%琼脂糖凝胶电泳，28S、18S、5S清晰可见(见图1)，说明所提取的RNA完整良好。利用反转录试剂盒反转录出cDNA第一条链。

图1 RNA 1%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 牦牛胎儿组织中HIF-1α mRNA的检测

2.2.1 牦牛胎儿不同组织内-1mRNA相对定量比较 由图2、图3可见，目的基因和内参基因熔解曲线峰值单一，引物特异性良好。海晏牦牛与泽库牦牛的胎儿组织中-1mRNA相对定量表明，-1mRNA在不同组织中均有转录，且-1mRNA在海晏牦牛和泽库牦牛的胎儿组织中转录水平具有相似性，表达量最高的都是脑组织，其次是肺脏和肾脏组织，心肌与骨骼肌组织最低，各组织间差异显著(<0.05)。

图2 目的基因(HIF-1α)qRT- PCR熔解曲线

图3 内参基因(β-actin)qRT-PCR熔解曲线

2.2.2 不同地区牦牛胎儿组织-1mRNA相对定量比较 通过比较海晏牦牛胎儿与泽库牦牛胎儿的脑、心肌、骨骼肌、肺、脾、肝、肾等7种组织-1mRNA相对转录水平(见图4)，结果显示泽库牦牛胎儿组织中-1mRNA转录水平显著高于海晏牦牛胎儿(<0.05)。

图4 不同地区牦牛胎儿组织中HIF-1α mRNA相对定量

2.3 牦牛胎儿组织中HIF-1α蛋白的检测

2.3.1 牦牛胎儿不同组织HIF-1α蛋白相对表达量比较 Western试验结果见图5，海晏牦牛和泽库牦牛的胎儿组织中HIF-1α蛋白均有表达，且在不同组织中HIF-1α的蛋白表达特点与其mRNA转录水平相似。表达量最高的是脑组织，其次是肺脏和肾脏组织，然后是心肌和骨骼肌组织，各组织间表达差异显著(<0.05)。

图5 牦牛胎儿不同组织HIF-1α蛋白印迹结果

2.3.2 不同地区牦牛胎儿组织HIF-1α蛋白相对表达量比较 由图6及图7可知，泽库牦牛胎儿组织中HIF-1α蛋白相对表达量显著高于海晏牦牛胎儿(<0.05)。

图6 不同地区牦牛胎儿组织中HIF-1α蛋白Western-blot分析结果

图7 不同地区牦牛胎儿组织中HIF-1α蛋白相对表达量

3 讨 论

平原健康哺乳动物进入高原，随着海拔升高，空气中氧分压下降，平原动物会发生肺血管肌化、血管壁增厚和肺血管收缩增强而导致的肺动脉高压，而牦牛等高原土著动物却鲜有肺动脉高压的发生，这与高原牦牛的心脏、肺脏适应性结构有关，这些结构特点使高原牦牛对氧的摄取及运输能力更强。杨琨等研究发现牦牛胎儿也有肺动脉内皮细胞变大并突入管腔等低氧适应的结构特点，这与胎儿在发育过程中受低氧相关基因调控有关。

HIF-1是由分子质量为120 ku的α亚基和分子质量为91～94 ku的3种不同β亚基组成。在常氧条件下HIF-1α亚基存在于细胞质中；当机体处于缺氧时，HIF-1α从细胞质易位至细胞核与HIF-1β结合成异二聚体。激活的HIF-1随后结合到下游目标基因缺氧反应元件(HRE)上，参与并启动与缺氧相关的一系列目标基因的转录。Schofield等研究发现，-1可调控超过100个与低氧适应相关的下游基因，涵盖血管及红细胞生成，能量代谢等方面。

但-1在各组织中的表达结果不完全相同。王德朋等研究发现，-1mRNA在家牦牛心脏、肝脏、肺脏多个组织中都有表达，其中最高的为睾丸与脾脏；高原鼠兔脑组织-1mRNA表达量最高；而高原鼢鼠肾组织-1的mRNA表达量最高，蛋白表达在心、肝和肺脏中的表达量高。本试验结果表明牦牛胎儿-1在不同的组织间均有表达，且不同海拔牦牛-1在组织中的表达特点具有相似性，均表现为脑组织表达量最高，其次是肺组织和肾组织，表达量最低的心肌与骨骼肌，这与赵同标等的研究结果一致；而比较不同海拔间胎儿7种主要组织或器官中HIF-1α的相对表达水平，结果显示泽库牦牛胎儿HIF-1α的相对表达量显著高于海晏牦牛，说明牦牛胎儿中HIF-1α的表达与海拔高度呈正相关，这是因为随着海拔升高氧含量逐渐降低，而HIF-1α作为低氧敏感基因，在基因缺氧时被激活表达，调控下游靶基因维持机体氧平衡，从而适应缺氧环境。

4 结 论

相同海拔牦牛胎儿不同组织中-1mRNA和蛋白均有表达并具有一致性，且泽库牦牛胎儿-1的表达量显著高于海晏牦牛，说明其表达具有差异性且随海拔的升高而增加，提示牦牛胎儿时期-1发挥着重要作用，推测这种表达特征与牦牛胎儿在出生前为适应低氧环境做出的适应性改变有关。