杂交构树青贮饲料对奶山羊精液品质和粪便微生物群落结构的影响

杜烨青，任 发，李 宇，席华明，王 智，温 飞，张利坤，胡建宏

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

奶山羊养殖作为陕西传统优势产业，是陕西特色农业的重要组成部分。随着奶山羊养殖规模的扩大，优质饲草短缺等问题日益严重，影响奶山羊养殖的经济效益，阻碍了奶山羊产业的发展。杂交构树(Hybrid，HBP)是中科院植物所培育的一种高蛋白、高营养、低成本的新型木本饲料原料，营养丰富，含有多种活性物质，能够有效替代苜蓿等高成本饲草作为奶山羊养殖的主要粗饲料来源。刘玉等研究发现，杂交构树的最佳刈割高度为1.0～1.5 m左右，这时候全株杂交构树粗蛋白含量为20.5%～23%，木质素等粗纤维含量相对较低，用来制作全株杂交构树青贮效果较好。长期饲喂青贮饲料会改变动物肠道微生物群落结构，而动物肠道微生物群落结构改变可能会对其精液品质产生影响。Ding等研究发现，将高脂饮食小鼠粪便微生物移植到正常饮食老鼠肠道中，会使老鼠精子密度和精子活力降低；Inatomi等也发现在基础日粮中添加淀粉芽孢杆菌能够在一定程度上改善鸡精液品质，提高精液抗氧化性。

本试验以奶山羊为研究对象，对照组饲喂苜蓿干草，试验组饲喂杂交构树青贮饲料，通过检测奶山羊精液品质，利用16S rDNA扩增子测序技术检测公羊粪便微生物群落结构和组成，初步探讨了杂交构树青贮饲料对奶山羊粪便微生物群落结构与精液品质的影响，为杂交构树青贮饲料的进一步开发和利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计

本试验于2019年9月21日至12月1日在陕西某奶山羊育种公司奶山羊养殖场进行。试验期70 d，其中预饲期10 d，正饲期60 d。选取8月龄左右、体重(34±2.3)kg、健康状况良好的关中奶山羊公羊30只，随机分为2组，每组15只，试验组以青贮杂交构树饲料+花生秧为粗饲料，对照组以苜蓿干草+花生秧为粗饲料。杂交构树青贮由陕西某饲草公司提供，于2019年7月份，杂交构树高度为1.2 m左右收割，全株粉碎至1～2 cm，制作裹包青贮，每包约重80 kg，试验所用其他饲料原料均由奶山羊育种公司提供。

1.2 试验饲粮

试验采用全混合日粮(TMR)，两种饲料按照等能等氮原则配制，营养水平参照NRC(2007)设计，并参照赵明明等的方法计算饲料的代谢能(ME)。饲料配方和营养水平见表1。

表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1.3 饲养管理

试验羊分栏饲养，每天早7：00和晚18：00各饲喂一次，中午补饲玉米，自由采食，自由饮水，每次饲喂前清理之前的剩料。试验开始前按规定对羊舍进行消毒，对试验羊进行驱虫免疫，试验过程中保证羊舍清洁卫生。

1.4 样本采集及指标检测

1.4.1 精液样本采集 试验结束前1周分别从试验组和对照组中选择体况良好、健康无疾病的公羊进行采精，利用电刺激法采集公羊精液，5 min内送回实验室，放置于37 ℃水浴锅内，利用计算机辅助精子分析(Computer assisted sperm analysis，CASA)检测公羊精液品质。

1.4.2 精液品质检测 取羊精液样品5 μL左右制片，置于37 ℃恒温载物台上，利用CASA检测精液品质，分别记下3个视野下的精子密度、精子活率和精子活力，取其平均值。

1.4.3 粪便样本采集 随机选择试验组和对照组体况良好、健康无疾病的公羊各5只，于试验结束时(第70天)早晨饲喂后约15 min采用部分收粪法采集粪样，粪便保存于灭菌试管中，-80 ℃贮存待测。

1.4.4 粪样16S rDNA测序 将采集的粪样送往诺和致源生物技术有限公司进行微生物16S rDNA基因测序分析。

1.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2010进行数据统计，通过SPSS 23.0软件进行统计学方差分析，利用GraphPad进行图表制作，采用检验进行显著性检。<0.05表示差异显著，<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 杂交构树青贮饲料对奶山羊精液品质的影响

精液品质检测结果如表2所示，试验组公羊精液精子密度为31.78×10·mL，显著高于对照组(22.22 ×10·mL)(<0.05)；试验组公羊精液量和精子活力比对照组分别高19.39%和5.27%，但差异均不显著(>0.05)。

表2 杂交构树青贮对公羊精液常规指标

2.2 组间微生物差异物种分析

组间微生物差异物种分析结果如图1所示。在门水平上，奶山羊粪便中的微生物主要有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)，其中试验组拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度显著高于对照组，变形菌门(Proteobacteria)丰度显著低于对照组(<0.01)；在目水平上，试验组奶山羊粪便中拟杆菌目(Bacteroidales)显著高于对照组，气单胞菌目(Aeromonadales)显著低于对照组(<0.01)；在科水平上，试验组奶山羊粪便中理研菌科(Rikenellaceae)显著高于对照组，琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)显著低于对照组(<0.01)。

图1 奶山羊粪便微生物种群结构差异分析

3 讨 论

3.1 杂交构树青贮饲料对奶山羊粪便微生物群落结构的影响

奶山羊肠道内存在细菌、真菌、原虫和古细菌等多种微生物，对山羊的消化吸收、免疫系统发育、胃肠道功能、繁殖性能、甚至脑部活动都有一定影响。一般情况下，附生在山羊肠道内的微生物种类大致相同，但长期饲喂不同饲料会导致其微生物菌群结构发生一定的改变，从而影响山羊的生长与发育。本试验通过对奶山羊粪便进行16S rDNA基因测序，结果发现其中门水平相对丰度最高的为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)。通过进一步检测分析发现，饲喂杂交构树青贮饲料能够增加公羊粪便中拟杆菌纲(Bacteroides)、拟杆菌目(Bacteroidales)和理研菌科(Rikenellaceae)的丰度，减少γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、气单胞菌目(Aeromonadales)和琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)的丰度，这可能是由于杂交构树在青贮过程中乳杆菌数量增加，产生乳酸、挥发性脂肪酸和各种细菌素等物质，快速降低了青贮饲料的pH，抑制了有害菌的生长，导致杂交构树青贮饲料中的微生物群落结构改变，提高了饲料品质，从而改善奶山羊后肠道微生物群落结构，维持后肠道健康，为奶山羊的机体健康和生长发育带来积极影响。

3.2 杂交构树青贮饲料对奶山羊精液品质的影响

在正常情况下，影响畜禽精液品质的因素很多，其中遗传因素对精液品质的影响只占10%，其余90%由环境因素决定，而外部环境因素包括饲养管理、营养水平、采精方式等。本试验利用电刺激法采集8月龄左右的公羊精液，对照组平均精液量为0.98±0.42 mL，试验组平均精液量为1.17±0.41 mL，差异不显著，表明与饲喂苜蓿干草相比，杂交构树青贮饲料对奶山羊精液量没有显著影响。山羊精子密度一般在30×10～40×10/mL，而本试验中的精子密度在20×10～30×10/mL，这可能是由于电刺激使公羊副性腺收缩变强，导致收集的精液中精浆变多。精子活力和精子密度有一定关系，精子活力能够充分反映精子的授精能力。本试验中饲喂杂交构树青贮饲料的公羊精液精子密度显著高于苜蓿干草饲喂组，表明杂交构树青贮饲料能够在一定程度上改善奶山羊精液品质，这可能与奶山羊后肠道微生物群落结构改善和杂交构树的抗氧化能力有关。

反刍动物肠道健康情况与其肠道微生物的组成和作用密切相关。肠道微生物具有充当神经化学传递载体的能力，调节和干预动物的神经或免疫系统，形成“肠道微生物-肠道-脑轴”的作用方式，对其生长发育、能量代谢以及中枢神经信号传导等都有一定影响。MacFabe研究发现，粪肠球菌()能够在动物胃肠道中产生多巴胺，实现细菌与宿主之间的双向通讯，说明肠道微生物菌群结构的改变确实通过某种方式影响着动物的生长发育和繁殖。本试验中，饲喂杂交构树青贮饲料能够显著减少奶山羊后肠道中的变形菌门和气单胞菌目的细菌丰度，而变形菌门和气单胞菌目细菌中存在很多致病菌，这些致病菌虽然没有引发疾病，但能给奶山羊肠道健康带来危害。特别是气单胞菌属细菌，其属于兼性厌氧、葡萄糖代谢呼吸型兼发酵型细菌，利用糖和有机酸作为碳源，部分气单胞菌能够分泌肠毒素，破坏肠道上皮细胞和黏膜结构，引起肠道功能紊乱，影响奶山羊对日粮蛋白质的消化和吸收，青年公羊对蛋白质的需求量大，如果蛋白摄入不足，很容易影响睾丸发育，甚至出现无精子等症状，从而影响奶山羊精子密度。

目前的研究发现，肠道微生物能够参与饲草中酚类化合物的分解，例如黄酮、黄烷醇等植物中常见的酚类化合物能够通过微生物被肠道吸收，这些活性物质被肠道吸收后通过门静脉运输到动物其他组织和器官，发挥抗菌、抗氧化作用。杂交构树中含有大量黄酮类和酚类化合物，黄酮和酚苷类化合物分子中有较多的羟基，能够捕获自由基，提供氢离子，竞争性结合组织活细胞内的活性氧，起到抗氧化的作用，杂交构树青贮饲料中的黄酮类和酚苷类化合物被奶山羊肠道吸收后，能够通过血液运输到睾丸等器官，清除自由基和活性氧，发挥抗氧化作用，有效保护精子免受氧化应激损伤，从而提高羊精子密度和精子活力，改善精液品质。

4 结 论

饲喂杂交构树青贮饲料能够显著提高奶山羊粪便中拟杆菌门的丰度，降低变形菌门丰度，改善奶山羊后肠道微生物的群落结构，维持后肠道健康，促进奶山羊生长发育，改善繁殖性能，在一定程度上提高奶山羊精液品质。