尪痹舒通过调控Th17/Tregs平衡缓解类风湿关节炎进展

万彬彬 杨惠琴 (武汉市第一医院风湿免疫科，湖北 武汉 430022)

类风湿关节炎(RA)临床特征主要为关节结构肿胀与炎症、慢性进行性病程，可导致关节功能丧失，是一种顽固的慢性全身性自身免疫疾病〔1〕。其主要的病理改变为关节骨质与软骨的破坏及滑膜慢性炎症，目前RA的发病机制尚不明确，但较多的研究提到Tregs与Th17细胞对其具有重要的影响〔2〕。RA发病可能是一种受抗原驱动的“激发-连锁反应”过程，其发病与病情迁延的中心环节为感染与自身免疫反应，而环境、遗传与内分泌因素等增加了RA的易感性〔3〕。多数西药对RA也仅能在一定程度控制炎症与疼痛，目前尚无特效药，并不能有效地治疗RA〔4,5〕。中医学认为，RA属“痹症”范畴，深入了解RA疗效机制，对提高患者生活质量意义重大，尪痹舒具有活血通络、祛风止痛、滋补肝肾、益气补血等功效〔6〕。本文探讨尪痹舒通过调控Th17/Tregs平衡缓解RA进展的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 选取40只清洁级、SD大鼠，6～8周龄，平均(6.9±0.6)周龄，体重200～230 g，平均(215.4±20.6)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供〔动物批准文号：SCXK(沪)2013-0018〕，大鼠实验前均适应性饲养在中科院动物饲养中心，且经中科院伦理委员会批准。主要试剂及仪器：甲氨蝶呤(通化茂祥制药有限公司，批号：国药准字H22022674，规格2.5 mg×100片)；完全弗氏佐剂(上海尚宝生物科技有限公司生产，型号：F5881-10)；显微镜(日本奥林巴斯公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；一抗、二抗(北京中杉金桥生物技术公司)；CO2培养箱(美国Thermo-fisher公司)。

1.2RA模型建立 模型组、甲氨蝶呤组及尪痹舒组大鼠腹腔麻醉使用5%水合氯醛0.8 ml/100 g，常规皮肤消毒在右后足跖底部取3个点，皮内注射0.1 ml完全弗氏佐剂。正常组处理方法与其他组相同，完全弗氏佐剂使用生理盐水代替。

1.3用药及分组 建模成功，正常组大鼠10只，将其他大鼠随机分为模型组、甲氨蝶呤组及尪痹舒组各10只，正常组、模型组给予等量的生理盐水；甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤10 mg，1次/w；尪痹舒组给予尪痹舒，药物组成：马钱子0.3 g、白芥子5 g、赤芍10 g、香附5 g、黄柏3 g、苍术6 g、僵蚕3 g组成，煎服300 ml，1剂/d，分3次用药，连续干预4 w。

1.4观察指标 关节肿胀数使用游标卡尺测量4组大鼠双后肢足垫厚度，两个分值相加为每只大鼠关节评分；关节疼痛指数、关节压痛指数采用慢性关节测定评分方法测定，大鼠安静时检测，固定10 min后，每隔5 s进行1次，大鼠踝关节做被动跖屈运动，共5次，取平均值，根据大鼠嘶叫与缩腿反应。

1.5病理学观察 干预后，取后踝关节部分分离关节滑膜组织，10%甲醛固定24 h，经脱钙、脱水、透明及包埋等处理制成石蜡块，保存待用。将组织进行切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察病理学变化。

1.6类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)及红细胞沉降率(ESR)水平检测 干预后，抽取大鼠下腔静脉血3 ml，以1 000 r/min低温离心15 min，取血清。采用免疫比浊法检测RF水平；采用ELISA检测CRP水平；采用魏氏血沉法检测ESR水平。

1.7转化生长因子(TGF)-β1、白细胞介素(IL)-17及IL-10水平检测 采用双抗体夹心法检测TGF-β1、IL-17及IL-10水平。

1.8Western印迹检测核孤儿受体(ROR)-γt、叉头翼状螺旋转录因子(Fox)p3蛋白 将所采集到的所有标本，进行研磨，然后加入蛋白缓冲液，常规蛋白提取，二喹啉甲酸(BCA)法定量分析。50 μg蛋白样品上样后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在TBST中将5%的脱脂奶粉避光封闭1 h，洗涤后加入一抗稀释溶液(ROR-γt、Foxp3按照1∶1 000比例进行稀释)，在4℃的环境中保存过夜，洗涤后加入二抗稀释溶液(ROR-γt、Foxp3按照1∶5 000比例进行稀释)，在温床中孵育1 h后再次洗涤，加入电化学发光(ECL)液，使软件分析蛋白条带灰度值，内参蛋白是GAPDH。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.14组关节肿胀数、关节疼痛指数与关节压痛指数比较 与正常组比较，其余3组关节肿胀数、关节疼痛指数与关节压痛指数明显升高(P<0.05)；与模型组比较，甲氨蝶呤组、尪痹舒组关节肿胀数、关节疼痛指数与关节压痛指数明显降低(P<0.05)；与甲氨蝶呤组比较，尪痹舒组关节肿胀数、关节疼痛指数与关节压痛指数明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 4组关节肿胀数、关节疼痛指数与 关节压痛指数比较分，n=10)

2.24组关节组织病理学观察 正常组膝关节滑膜无充血及水肿，细胞排列整齐，关节软骨完整，无炎性细胞浸润，无剥离及坏死，组织完整；模型组关节软骨面糜烂，滑膜内血管增生，肉芽组织形成，细胞显著增生；甲氨蝶呤组滑膜血管水肿、充血，见炎性细胞浸润，表层细胞增，呈“栅栏”状排列；尪痹舒组未见明显炎细胞浸润及血管增生，间质多为脂肪组织，纤维化不明显，充血程度、滑膜肿胀及滑膜细胞增生减轻。见图1。

图1 4组关节组织病理学观察(HE染色，×200)

2.34组RF、CRP及ESR水平比较 与正常组比较，其余3组RF、CRP及ESR水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，甲氨蝶呤组、尪痹舒组RF、CRP及ESR水平明显降低(P<0.05)；与甲氨蝶呤组比较，尪痹舒组RF、CRP及ESR水平明显降低(P<0.05)。见表2。

2.44组TGF-β1、IL-17及IL-10水平比较 与正常组比较，其余3组IL-17水平明显升高，TGF-β1、IL-10水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，甲氨蝶呤组及尪痹舒组IL-17水平明显降低，TGF-β1、IL-10水平明显升高(P<0.05)；与甲氨蝶呤组比较，尪痹舒组IL-17水平明显降低，TGF-β1、IL-10水平明显升高(P<0.05)。见表2。

2.54组ROR-γt、Foxp3蛋白表达比较 与正常组比较，其余3组ROR-γt蛋白表达明显升高，Foxp3蛋白表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，甲氨蝶呤组、尪痹舒组ROR-γt蛋白表达明显降低，Foxp3蛋白表达明显升高(P<0.05)；与甲氨蝶呤组比较，尪痹舒组ROR-γt蛋白表达明显降低，Foxp3蛋白表达明显升高(P<0.05)。见表3、图2。

表2 4组RF、CRP、ESR、TGF-β1、IL-17及IL-10水平比较

表3 4组ROR-γt、Foxp3蛋白表达比较

图2 4组ROR-γt、Foxp3蛋白表达

3 讨 论

RA经常伴有关节外器官受累，致残与致畸率较高，其病程长，是临床上常见的高致残性风湿免疫病，是一种进行性、慢性的累及关节的自身免疫性疾病〔7〕。RA患病率在我国较高，很多患者没有接受规范治疗，患病人群构成复杂，严重影响患者预后。RA中医学上属痹症，痹，即痹阻不通，《临证指南医案》〔8〕中指出痹者，脏腑经络不能畅达，正气为邪所阻，闭而不通之谓，湿、寒、风三气得以乘虚外袭，体内留置，导致湿痰浊血留注凝涩而德之〔9〕。相关研究表明，痰瘀是本病中晚期发病的重要病理因素，正气亏虚为本，多以湿热偏盛为主，病情迁延郁久化热，从阳化热，复感外邪〔10〕。

尪痹舒中黄柏、苍术、僵蚕组成,黄柏、苍术即二妙散具清热燥湿功效，为湿热痹痛常用药。白芥子具有豁痰利气，散结通络止痛，僵蚕具有化痰散结、祛风止痛解痉的功效，两者联合用于治疗痰湿流注，关节肿胀麻木、疼痛诸症。马钱子，通络止痛，散结消肿。赤芍具有清热凉血、散瘀止痛的功能。香附为佐药具有利三焦、解六郁的功用，有和胃理气止痛作用，为气病之总司但对痰、瘀、食、湿等诸郁均有效，对于以上诸药对胃的刺激有一定的缓解作用。诸药和用共奏清热除湿、祛痰活血、通痹消肿的功效。本研究说明尪痹舒显著改善关节肿胀数、关节疼痛指数与关节压痛指数。赤芍凉血活血、清热，对细菌有明显的抑制作用〔11〕。本研究说明尪痹舒显著降低RF、CRP及ESR水平。Tregs细胞通过释放细胞因子IL-10等降低炎症因子产生与抗体分泌，是T细胞亚群中具有免疫抑制活性的一类，发挥免疫效应〔12〕。IL-17在RA早期炎症反应中起重要作用，诱导炎性细胞释放促炎因子，上调免疫应答，促进滑膜成纤维细胞、内皮细胞释放IL-8、IL-6，导致滑膜异常增生〔13〕。TGF-β1与关节炎的病理改变有关，可显著抑制机体的炎症反应与免疫反应〔14〕。机体Th17/调节性T细胞的失衡与相关细胞因子的异常在RA的发病中发挥重要的作用，是与免疫细胞比例异常的重要原因〔15〕。Th17细胞/调节性T细胞亚群失衡可导致RA骨质破坏。Th17细胞可分泌IL-17，IL-17能够对细胞外基质损伤起到促进愈合作用，也可对组织炎症具有明显的促进作用〔16〕。Tregs细胞可通过产生的细胞因子包括TGF-β1与IL-10等在RA中起免疫抑制作用，也可直接发挥免疫抑制作用〔17,18〕。本研究结果说明尪痹舒显著改善炎症反应。此外，尪痹舒明显降低ROR-γt蛋白表达，升高Foxp3蛋白表达。Foxp3蛋白是Tregs的特异性标志物，维持Tregs活性的关键因素为Foxp3持续表达〔19〕。ROR-γt是Th17细胞特异性的转录调控因子，作为促进细胞分化的关键转录调节因子参与了体内Th17细胞介导的炎症反应及体外细胞因子诱导Th17细胞的分化〔20〕。

综上，尪痹舒可通过诱导Tregs细胞生成同时抑制Th17细胞分化，是病变部位Th17/Tregs恢复平衡，可调控Th17/Tregs改善炎症反应与ROR-γt、Foxp3蛋白表达。