白藜芦醇调控Wnt/β-catenin信号通路抑制胶质瘤细胞的机制*

宁晓丽， 王炎， 余跃

(安徽医科大学附属巢湖医院 麻醉与疼痛科， 安徽 合肥 238000)

胶质瘤是中枢神经系统最具有侵袭性的肿瘤之一，其发病率和死亡率均居世界前列[1]。尽管随着医疗技术的发展，对于各类肿瘤的治疗效果已经取得了巨大进展，但是胶质瘤患者的预后仍然较差、死亡率较高，主要是因为胶质瘤具有较强的增殖性和侵袭能力，因此对胶质瘤患者的治疗可考虑由其分子机制入手，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，提高凋亡率，以获得较佳的临床疗效[2]。白藜芦醇是花生、葡萄、虎杖等植物中广泛存在的物质，已有作为一种抗氧剂，能够抑制血小板聚集、预防心脑血管疾病，临床多将其用于对冠心病、动脉粥样硬化、高血脂以及缺血性心脏病等患者的防治中[3]。白藜芦醇可抑制多种细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡，并在结肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等的研究中获得一定的效果，虽然尚未明确其具体作用机制，但是其作用效果仍为临床治疗胶质瘤患者提供了新的方向[4]。Wnt信号转导通路对于胚胎的生长和形态发育具有一定调控作用，且Wnt/β-catenin信号转导通路已经明确与胶质瘤的发生和发展相关[5]，因此本研究从白藜芦醇对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用来分析其对胶质瘤细胞的作用机制，以期能为临床治疗提供参考，现报道如下。

1 村料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 由上海中国科学院细胞库购入胶质瘤细胞株U251，将其培养于高糖克改良伊格尔培养基(dulbecco modified eagle medium, DMEM)培养基(四季青公司，含10%胎牛血清、链霉素 10 mg/L、青霉素105 IU/L)，置于5%二氧化碳(carbon dioxide，CO2)、37 ℃的细胞恒温培养箱内培养，细胞融合度为70%及以上时进行细胞传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1.1.2试剂与器材 试剂：胎牛血清(杭州江滨生物技术有限公司)、DMEM细胞培养液(美国Hyclone公司)、二甲基亚砜[百运渡(上海)生物科技有限公司]、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、噻唑蓝(武汉卡诺斯科技有限公司)、CCK-8试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、Annexin V/PI凋亡试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、反转录试剂盒(伊艾博医疗有限公司)、实时定量PCR(real-time quantitative，qPCR)试剂盒(日本Toyobo公司)、碘化丙啶(PI，西安瑞禧生物科技有限公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma公司)、磷酸缓冲盐溶液(PBS，武汉普诺赛生命科技有限公司)、SYBR mix(碧云天生物技术有限公司)、注射用白藜芦醇(扶风斯诺特生物科技有限公司)。器材：超净工作台(山东博科生物产业有限公司)、恒温培养箱(无锡玛瑞特科技有限公司)、电子天平(邢台中德机械制造有限公司)、TGL-16台式高速离心机(金坛市科析仪器有限公司)、酶标仪(美国Thermo公司)、流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1CCK-8试剂盒检测细胞活性 将胶质瘤细胞U251细胞接种于完全培养基(100 μL)的96孔板内，密度为2×103细胞/孔，细胞贴壁后，分别于每孔内加入0(对照组)、25(低剂量组)、50(中剂量组)以及100 μmol/L(高剂量组)的白藜芦醇[6]进行24、48、72 h处理；并在各时间点处理完毕后弃去培养液，每孔内加入100 μL二甲基亚砜，室温下震荡10 min，使用酶联免疫检测仪检测波长450 nm的吸光值(OD值)。

1.2.2Transwells小室检测细胞迁移和侵袭情况 (1)迁移：在Transwell小室上室内加入DMEM培养基(1 ∶8稀释)，将0.5 g/L Fibronectin使用移液枪涂抹至下室面，置于5%CO2、37 ℃的培养箱内包被2 h，加Matrigel凝固成胶，置于4 ℃下过夜风干；将所取U251细胞分别加入0(对照组)、25(低剂量组)、50(中剂量组)以及100 μmol/L(高剂量组)的白藜芦醇干预24、48以及72 h；将细胞拿出小室，并吸去残余液体，每小室内加入100 μL的DMEM，置于37 ℃孵育30 min，水化基底膜。收集各组细胞，重悬于DMEM培养液内，调整密度为5×107/L，接种于上室，下室内加入10%胎牛血清的DMEM培养液(600 μL)，置于5%CO2、37 ℃下培养24 h，取出小室，PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛室温下固定15 min，PBS清洗2次，将上室面残余细胞擦拭干净，使用结晶紫染色15 min，使用200倍光镜观察穿膜细胞数，设3个独立样本，由两位实验人员平行观测各2次；(2)侵袭：操作同迁移检测实验，各组细胞培养24、48以及72 h后，将小室上层细胞和Matrigel基质胶轻擦后PBS洗涤3次，后续操作同迁移检测，封片后拍照观察6个视野的细胞计数。

1.2.3Annexin V/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡率 收集白藜芦醇处理的各组细胞，使用PBS清洗3次，25 ℃， Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL对细胞悬液进行黑暗染色15 min，混匀置于2～8 ℃下孵育5 min，1 h内使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，各设3个独立样本，由两位实验人员平行观测各2次，依据散点图计算各组细胞的凋亡率。

1.2.4Western blot检测细胞Wnt3a、β-catenin蛋白表达 将对数生长期U251细胞内加入蛋白酶抑制剂PMSF和RIPA裂解缓冲液，4 ℃下孵育30 min，以12 000 r/min的速率离心10 min(半径7 cm)，分离细胞碎片。使用蛋白浓度定量法对蛋白浓度进行测定，加入蛋白上样缓冲液煮沸蛋白5 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(90 min)，以分离蛋白；用湿转法将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上(PVDF)，切取目的条带PVDF膜，使用5%脱脂奶粉封闭液于室温下封闭2h，分别加入一抗Wnt3a(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)，置于4 ℃下反应过夜；使用TBST洗膜3次、5 min/次，然后加入对应二抗(稀释比例均为1 ∶10 000)，置于37 ℃下孵育2 h，TBST洗膜2次、10 min/次，以β-actin为参照，电化学发光法显影。

1.2.5RT-qPCR检测Wnt3a、β-cateninmRNA表达 使用Trizol试剂盒提取U251细胞总RNA，使用RNA反转录试剂盒反转录为cDNA，在Bio-Rad IQ5 PCR仪上扩增，并检测mRNA表达量。反应体系为cDNA模板1 μL，SYBR mix 10 μL，20 μmol/L PCR上下游引物各1 μL，RNA无酶水20 μL。条件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40个循环；72 ℃、30 s，72 ℃、10 min。β-catenin上游引物5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′，下游引物5′-TGCATATGTCGCCACACC-3′；Wnt3a上游引物5′-GTCACCTAGCAAGCTGCCGAACC-3′，下游引物5′-CGACAGACAAAGCGTCCCTCAAG-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞活性

与对照组相比，各白藜芦醇培养组细胞培养24、48以及72 h时细胞活性均降低，且各白藜芦醇培养组的细胞活性随培养时间的延长而降低(P<0.05)；各培养时间下，低剂量组的细胞活性均最高，高剂量组均最低，差异有统计学意义(P<0.025)。见表1。

表1 不同培养时间下各组细胞的活性比较Tab.1 Comparison of cell viability at different time points in each

2.2 细胞侵袭实验

与对照组相比，各白藜芦醇培养组细胞培养24、48、72 h时细胞侵袭个数均减少，且各白藜芦醇培养组的细胞侵袭个数均随培养时间的延长而增加(P<0.05)；各培养时间下，低剂量组的细胞侵袭个数均最多，高剂量组均最少，差异有统计学意义(P<0.025)。见表2、图1。

图1 各组细胞的侵袭实验结果(Transwells小室，×400)Fig.1 Cell Invasion at different time points in each group (Transwell chamber,×400)

表2 不同培养时间下各组的细胞侵袭个数比较Tab.2 Comparison of invading cell numbers at different time points in each

2.3 细胞迁移实验

与对照组相比，各白藜芦醇培养组细胞培养24 h、48 h、72 h时细胞迁移个数均减少，且各白藜芦醇培养组的细胞迁移个数均随培养时间的延长而增加，差异有统计学意义(P<0.05)；各培养时间下，低剂量组的细胞迁移个数均最多，高剂量组均最少，差异有统计学意义(P<0.025)。见表3、图2。

表3 不同培养时间各组细胞迁移数比较Tab.3 Comparison of migrating cell numbers at different time points in each

图2 不同培养时间各组细胞的迁移情况(Transwells小室，×400)Fig.2 Cell migration at different time points in each group (Transwell chamber,×400)

2.4 细胞凋亡率

与对照组相比，各白藜芦醇培养组细胞培养24、48以及72 h时细胞凋亡率均升高，且各白藜芦醇培养组的细胞凋亡率均随培养时间的延长而增加(P<0.05)；各培养时间下，低剂量组的细胞凋亡率均最低，高剂量组均最高，差异有统计学意义(P<0.025)。见表4、图3。

图3 不同培养时间下各组细胞的凋亡情况Fig.3 Cellular apoptosis at different time points in each group

表4 不同培养时间下各组细胞的凋亡率比较Tab.4 Comparison of apoptotic rates at different time points in each

2.5 Wnt3a、β-catenin蛋白表达

与对照组相比，各白藜芦醇培养组细胞培养72 h时Wnt3a、β-catenin蛋白表达均降低，且低剂量组的细胞Wnt3a、β-catenin蛋白表达最高，高剂量组最低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、图4。

表5 各组细胞培养72 h时的Wnt3a、β-catenin蛋白表达Tab.5 The relative protein expression levels of Wnt3a and β-catenin at 72 h after the treatment in each

图4 各组细胞培养72 h时的Wnt3a、β-catenin蛋白表达(Western blot)Fig.4 The protein expression levels of Wnt3a and β-catenin at 72 h after the treatment in each group (Western blot)

2.6 Wnt3a、β-catenin mRNA水平

与对照组相比，各白藜芦醇培养组细胞培养72 h时Wnt3a、β-cateninmRNA水平均降低，且低剂量组的细胞Wnt3a、β-cateninmRNA水平最高，高剂量组最低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 各组细胞培养72 h时的Wnt3a、β-catenin mRNA水平Tab.6 The relative mRNA levels of Wnt3a and β-catenin at 72 h after the treatment in each

3 讨论

Wnt/β-catenin信号通路是一个能够调控胚胎发育、组织器官形成的高度保守通路，其能够激活β-catenin，促使其在细胞核内聚集，进而影响靶基因的转录和表达，对细胞生长进行调控[7-8]。机体在正常状态下的Wnt/β-catenin信号通路为抑制状态，细胞内的β-catenin及其他蛋白以复合物的形式存在于体内，但当机体遭受某些刺激时，泛素蛋白酶依赖的蛋白降解，进而促使机体内β-catenin复合物降解成为β-catenin，导致机体内β-catenin表达明显升高，激活Wnt/β-catenin信号通路[9-10]。研究发现，鼻咽癌、肝癌、舌鳞癌等多种癌症患者体内均存在β-catenin过度表达的情况，而给予患者Wnt/β-catenin信号通路抑制剂则能够抑制肝癌细胞等癌细胞的生长、迁移能力，为临床治疗提供了新方向[11-12]。

白藜芦醇作为植物内常见的含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，早期研究发现其具有抗菌、抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化、保肝、降血脂、平喘、镇咳以及免疫调节等生物活性[13-14]。近年来，有学者指出白藜芦醇可发挥抗肿瘤效果，如给予结肠癌细胞系HCT116白藜芦醇培养，能够对多种信号传导通路产生抑制，进而抑制癌细胞增殖[15-16]。细胞恶性增殖为肿瘤的生物特性之一，其主要机制为生物周期紊乱而导致的凋亡受阻和增殖过多，进而导致肿瘤细胞始终处于无法进入静止期的增殖期，而使癌细胞快速增殖，加速病情进展[17-19]。本文研究结果显示，给予胶质瘤细胞U251白藜芦醇干预后，其可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制胶质瘤细胞活性，减少细胞侵袭和迁移，促进细胞凋亡，且随着白藜芦醇剂量的升高而作用增强。胰岛素样生长因子-1能够对Wnt/β-catenin信号通路的下游激酶磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及蛋白激酶B(Akt)产生刺激，进而增加Akt、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的磷酸化和细胞周期蛋白D1水平，促进肿瘤细胞增殖[20-21]。当给予胶质瘤U251白藜芦醇干预时，其能够抑制IGF-1诱导的IGF-1受体-Akt-Wnt信号传导通路，进而下调IGF-1受体信号蛋白表达，抑制胶质瘤细胞的增殖[22-23]。经典Wnt信号通路中，β-catenin浓度为通路的中心地位，若为Wnt信号分子存在，则β-catenin被CKI和GSK3β磷酸化后进入蛋白酶体内降解，而Wnt蛋白与受体结合，则能够通过膜上信号引导APC复合体解体，促使机体内β-catenin表达升高[24-25]。因此在本研究给予胶质瘤细胞U251白藜芦醇干预后，细胞内异常聚集的β-catenin水平降低，进而抑制了c-Myc和cyclinD1基因的表达，进而发挥抑制胶质瘤细胞生长的效果。但是白藜芦醇如何降低异常聚集β-catenin表达，如何促使其降解，或者降低其转录的具体作用机制仍需要进一步探究。

综上所述，白藜芦醇可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制胶质瘤细胞活性，减少细胞侵袭和迁移，促进细胞凋亡。