和胃安神方治疗失眠的网络药理学和分子对接机制研究

王亮 王鹏 侯晓圆 李晨 张俊修 李绍旦 杨明会

摘要 目的：通過网络药理学和分子对接研究和胃安神方（HWASF）治疗失眠的作用机制。方法：采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），筛选出HWASF主要有效成分和各中药靶蛋白;在生物信息综合数据库（GeneCards）搜索失眠疾病靶点;利用R语言将HWASF-Insomnia靶点取交集并绘制韦恩图，上传STRING和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图;交集靶点投射到Metascape基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析;采用Cytoscape插件构建调控网络图;以蛋白自带配体为中心完成分子对接等可视化操作、构象评分和结合模式分析。结果：通过TCMSP并结合文献，筛选出HWASF中19个有效成分与134个中药靶点数;GeneCards数据库获得 074个失眠靶点，经韦恩图得到49个HWASF-Insomnia共有靶点;GO富集发现HWASF治疗失眠可能参与第二信使介导信号传输、凋亡等多项生物过程，体现突触后膜整体成分、细胞体等多种细胞功能，包括肾上腺素能受体活性、神经递质受体活性等多类分子功能;筛选其靶点富集于多巴胺能突触、5-羟色胺能突触等多条KEGG信号通路，涉及药物代谢、神经递质、细胞凋亡、免疫等功能。分子对接发现HWASF可通过山柰酚等有效成分作用于RELA等失眠靶点达到治疗失眠作用。结论：HWASF治疗失眠的作用机制可能与其调控RELA、TNF、FOS等核心基因及其通路的多靶点、多成分、多途径有密切关系。

关键词 和胃安神方;失眠;网络药理学;分子对接;作用机制;中药药理;山柰酚

Mechanism of Hewei Anshen Formula in Treating Insomnia based on Network Pharmacology and Molecular Docking

WANG Liang1，2，3，WANG Peng1，2，3，HOU Xiaoyuan1，2，3，LI Chen1，2，3，ZHANG Junxiu2，3，LI Shaodan2，3，YANG Minghui2，3

（ Chinese People′s Liberation Army Medical School，，Beijing 100853，China; 2 Department of Traditional Chinese Medicine，Chinese People′s Liberation Army General Hospital，Beijing 100853，China; 3 Department of Traditional Chinese Medicine，First Medical Center of Chinese People′s Liberation Army General Hospital，Beijing 100853，China）

Abstract Objective：To investigate the mechanism of Hewei Anshen Formula（HWASF） in the treatment of insomnia through network pharmacology and molecular docking.Methods：The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） was used to screen the main active ingredients of HWASF and target proteins of each Chinese medicine.The insomnia targets were searched in Genecards.The HWASF-insomnia targets intersected by R language and the Venn diagram was drawn and uploaded into STRING and Cytoscape to construct the protein-protein interaction（PPI） network.The intersection targets were projected to Metascape for Gene Ontology（GO） and Eyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis.The plugin of Cytoscape was adopted to construct regulatory network.By molecular docking，visualization operations，conformational scoring and binding mode analysis were completed with protein self-ligands as the center.Results：Nineteen active ingredients and 134 Chinese medicine targets in HWASF were screened through TCMSP combined with literature.A total of  074 insomnia targets were obtained from GeneCards，and 49 HWASF-insomnia common targets were obtained by the Venn diagram.GO enrichment analysis found HWASF in the treatment of insomnia may be involved in a number of biological processes such as second messenger-mediated signal transduction and apoptosis，reflecting various cellular functions such as those of the overall composition of postsynaptic membrane and cell body，which include adrenergic receptor activity，neurotransmitter receptors activity and other molecular functions.The screened targets were enriched in multiple KEGG signaling pathways such as dopaminergic and serotonergic synapses，involving drug metabolism，neurotransmitter function，apoptosis，and immunity.Molecular docking indicated that HWASF treated insomnia by acting on insomnia targets such as RELA via active ingredients such as kaempferol.Conclusion：The mechanism of HWASF in the treatment of insomnia may be closely related to its multi-target，multi-component and multi-pathway regulation of core genes such as RELA，TNF，and FOS and their pathways.

Keywords Hewei Anshen Formula; Insomnia; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism; Pharmacology of Chinese medicine; Kaempferol

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.013

失眠（Insomnia）是指睡眠启动困难、难以维持睡眠或清晨醒来无法恢复睡眠，导致与日间功能受损相关的认知能力下降、疲劳或情绪障碍等，表现出对睡眠时间或质量的不满意[1-3]。目前，临床治疗失眠常用如短/中效苯二氮艹卓类受体激动剂、褪黑素受体激动剂、镇静药和抗抑郁药等药物，但存在反跳性失眠、日间嗜睡、认知功能损害、依赖成瘾等危害[1]。在人群中失眠发病率较高，特别是随着现代饮食结构、生活习惯的不断改变，胃肠道负担加重，易影响睡眠时间和质量[4-5]。

中医学将失眠纳入“不寐”范畴，多为饮食不节、情志所伤、劳逸失调、久病体虚等因素引起脏腑气血阴阳失调、阳不入阴而发病。早在两千多年前《素问·逆调论篇》就提出“胃不和则卧不安”理论，并运用半夏秫米汤治疗“胃不和则卧不安”型不寐。既往研究表明，以半夏秫米汤为基础的和胃安神方由半夏、薏苡仁、白术、茯神、石菖蒲、远志、炒酸枣仁、柏子仁等配伍组成，其临床治疗失眠疗效显著，总有效率达90.7%，且随访失眠复发率低[6-8]。但中药复方和胃安神方成分较复杂，并不能较为全面地反映其治疗失眠的药理作用和通路机制。

作为大数据时代系统药物研究的新兴、交叉、前沿学科，中药网络药理学突破传统“一药一靶点”研究方法，从系统层次和生物网络的角度出发，探析药物及疾病之间的分子关联规律（如挖掘中药及其复方的活性化合物、阐明其整体作用机制、解析其药物组合和方剂配伍规律等），为中药及其复方系统研究提供了新思路，为中药新药研发、临床合理用药等提供了新的科技支撑[9-11]。因此，本研究借助网络药理学和分子对接技术，系统分析其主要活性成分、核心作用靶点，阐释和胃安神方治疗失眠的药理作用和分子机制，为进一步探究其临床、实验和数据挖掘提供参考依据。

资料与方法

1. 资料与软件 中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），生物信息综合数据库（GeneCards，http：//www.genecards.org/），在线UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），Venny 2.1在线平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），蛋白质相互作用数据库（STRING 11.0，https：//string-db.org/cgi/input.pl），基因注释在线平台（Metascape，https：//metascape.org/gp/index.html），蛋白质数据库（PROTEIN DATA BANK，http：//www.wwpdb.org/），ZINC数据库（ZINC，http：//zinc.docking.org），Cytoscape 3.7.2版软件，AUTODOCK和PYMOL软件[11-12]。

1.2 筛选HWASF有效成分及其靶点

通过TCMSP查找各中药有效成分的作用靶点，参照药代动力学的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME）特性，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18为条件进行筛选，并结合文献对未查询到的中药成分进行补充[13]。借助Uniprot数据库蛋白质信息对筛选得到的中药有效成分进行靶点注释，同时筛去Uniprot数据库中不包含的作用靶点，合并上述靶点删去重复值。根据已经获得的HWASF-Insomnia共同靶点，并结合文献反向筛选中药活性成分[14]。

1.3 检索失眠疾病靶点

在GeneCards中数据库以“Insomnia”为关键词，搜索失眠相关疾病靶点。

1.4 构建HWASF-Insomnia的蛋白质-蛋白质相互作用網络图

利用R语言将HWASF-Insomnia靶点取交集，绘制二者交集靶点韦恩图，将筛选得到的交集靶点上传至在线STRING 11.0数据库，并使用Cytoscape 3.7.2软件进行网络构建并绘制蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络图。

1.5 基因本体注释和京都基因和基因组百科全书信号通路富集分析

将HWASF-Insomnia交集靶基因投射到Metascape数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）注释和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，导入数据后，设置P<0.01，对获得数据可视化分析。

1.6 构建HWASF-Insomnia的“成分-靶点-作用通路”网络图

采用Cytoscape 3.7.2软件导入交集数据库“成分代码-靶点基因symbol”数据，构建以中药名称、交集靶基因和药物有效活性成分为节点的中药复方调控网络图。并应用其内置插件Network analyzer，分析各网络节点特征参数值，根据Degree、Betweeness、Closeness等参数值确定核心成分与核心靶点，并以连接度值大小取其前5位。

1.7 分子对接

通过PROTEIN DATA BANK、ZINC查找受体蛋白和配体小分子，并下载其3D结构，借助于AUTODOCK和PYMOL软件对蛋白结构进行去水、加氢及计算电荷处理，再以蛋白自带配体为中心构建分子对接空间结构等可视化操作，进行构象评分和结合模式分析。

2 结果

2. HWASF有效成分筛选结果

筛选出HWASF有效成分：白术23个，柏子仁46个，半夏172个，茯苓30个，石菖蒲75个，酸枣仁32个，薏苡仁76个，远志55个。对HWASF各成分作用靶点进行靶点注释结果如下：白术18个，柏子仁40个，半夏127个，茯苓21个，石菖蒲103个，酸枣仁46个，薏苡仁62个，远志46个，合并上述靶点删去重复值共有靶点134个。得到HWASF各中药活性成分19个。见表1。

2.2 获得Insomnia疾病靶点

在Genecards中以“Insomnia”为关键词搜索失眠疾病靶点得到2 564个靶点基因，取0.98为“relevance score”中位数值，并作为卡值，筛选疾病靶点，保留大于中位数值靶点，最终得到失眠相关靶点数为 074个。

2.3 构建HWASF-Insomnia的PPI网络图

使用Venny在线平台绘制HWASF-Insomnia共同靶点韦恩图，得到49个共同靶点，蓝色代表HWASF有效成分和靶标蛋白，黄色代表Insomnia靶标蛋白，中间代表二者交集靶点。见图1。图节点（node）大小、形状变化和颜色深浅反映自由度（Degree）值大小，Degree越大，说明节点在网络中越处于核心地位。见图2。

2.4 GO注释与KEGG富集分析

将49个HWASF-Insomnia交集靶基因输入到Metascape，对GO注释和KEGG信号通路分析的结果进行可视化分析。

GO富集注释分析结果显示，生物过程（Biological Process，BP）中说明HWASF治疗失眠与第二信使介导的信号传输、对脂多糖的反应、对氮化合物的细胞反应、循环系统中的血管过程、细胞成分运动的正调控、凋亡信号通路、反应性有毒物质、RNA聚合酶Ⅰ对pri-miRNA转录的正调控、突触信号、氧水平的反应等调控有关。而细胞组分（Cell Component，CC）涉及膜筏、突触后膜的整体成分、细胞体、轴突、受体复合物、突触后特化膜、质膜的外部、RNA聚合酶转录因子复合物、细胞质的核周区域、神经投射细胞质等。分子功能（Molecular Function，MF）包括肾上腺素能受体活性、核心启动子序列特异性DNA结合、神经递质受体活性、血红素结合、蛋白质同二聚活性、RNA聚合酶转录因子结合、蛋白磷酸酶2结合、单胺跨膜转运蛋白激活、肽结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合等分子活性调节。见图3。

筛选得到的前20条KEGG信号通路富集，涉及到癌症、药物代谢、神经递质、细胞凋亡、免疫等，排名靠前包括癌症通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、HIF-1信号通路、神经活性配体-受体相互作用、非洲锥虫病、雌激素信号通路、多巴胺能突触、5-羟色胺能突触等通路。见表2。

2.5 构建HWASF-Insomnia的“成分-靶点-作用通路”网络图

构建“成分代码-靶点基因symbol”网络图。见图4。分析图4各网络节点特征参数值，根据Degree、Betweeness、Closeness等参数值确定核心成分与核心靶点，并以连接度值大小取其前5位，HWASF主要活性成分网络节点特征参数见表3。失眠主要作用靶点网络节点特征参数见表4。

2.6 分子对接

根据表3网络节点特征参数发现山柰酚连接度最高（连接度为16）是HWASF主要成分，RELA等为主要作用靶点（连接度为20），因此以山柰酚作为配体小分子，RELA、TNF、FOS、TNFRSF1A和TP53作为受体蛋白进行分子对接对象。借助于PROTEIN DATA BANK查找受体蛋白的编码分别为1fos、1k3z、1oqe、7k7a;由ZINC查找配体小分子山柰酚，使用AUTODOCK软件进行分子对接，运用PYMOL软件将对接结果可视化，得到分子对接模式图;从对接结果和分子模式图中发现山柰酚可以结合于1fos、1k3z、1oqe、7k7a等受体蛋白，主要通过DT-36/DG-8、ILE-67/ARG-295/GLN-69/HIS-296/ARG-302、ASN-94/MET-95、LEU-232/ARG-235等氨基酸残基与山柰酚发生氢键作用，氢键的结合能分别为-4.6、-4.54、-4.63和-4.16。见图5。HWASF可能通过山柰酚等活性成分作用于RELA等靶点，从而达到治疗失眠的作用。

3 讨论

和胃安神方之立论基础源于“胃不和”与“卧不安”经典论述。在《医学心悟》“不得眠”篇中提到“不得眠……其狂乱不得眠者，阳明胃热故也”和“胃受熱邪故不和……故不眠”。方中各药对配伍是其治疗失眠的组方基础，其中半夏与薏苡仁、白术与茯苓配伍起到益气健脾、祛湿和胃的作用，石菖蒲与炙远志配伍侧重于祛痰开窍、化湿和胃;炒枣仁与柏子仁配伍兼有养血安神、宁心益智的作用，共奏调和脾胃、祛痰化湿、宁心安神的功效[15]。

本研究从HWASF中筛选出山柰酚、花生四烯酸、卡文定碱、黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、常春藤皂苷元等19个有效成分，其靶点主要影响AKT1、VEGFA、FOS、PPARG、NOS3等与失眠相关靶点，其睡眠调节主要参与第二信使介导的信号转导、对脂多糖的反应、对氮化合物的细胞反应、循环系统中的血管过程、细胞成分运动的正调控、凋亡信号通路、反应性有毒物质、RNA聚合酶Ⅰ对pri-miRNA转录的正调控、氧水平的反应等生物过程;涉及膜筏、突触后膜的整体成分、细胞体、RNA聚合酶转录因子复合物、细胞质的核周区域、神经投射细胞质等细胞组分;包括肾上腺素能受体活性、核心启动子序列特异性DNA结合、神经递质受体活性、蛋白质同二聚活性、RNA聚合酶转录因子结合、蛋白磷酸酶2结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合等分子功能。前20条KEGG富集涉及癌症通路、HIF-1信号通路、神经活性配体-受体相互作用、雌激素信号通路、多巴胺能突触、5-羟色胺能突触、AMPK信号通路等经典信号通路。分子对接发现以山柰酚为配体小分子与RELA、TNF、FOS、TP53等受体蛋白进行分子对接的氢键、结合能稳定，初步验证了和胃安神方治疗失眠可能的分子机制。

研究发现，睡眠不足会严重影响消化系统，体现了睡眠与脾胃功能之间的密切关系。研究表明，睡眠剥夺与氧化应激密切相关，自噬作为提高生存率的自卫策略可由氧化应激触发[16]，而AKT/mTOR信号通路是自噬的重要调节剂，在很多脏器组织AKT1中广泛存在，主要调控细胞增殖和生长。VEGFA，MCH神经元活化后的细胞活化评估显示了内皮细胞的MCH神经元依赖性调节。MCH神经元表达VEGFA，而阻断VEGFR信号转导会减弱MCH神经元激活的瘦素致敏作用[17]。研究证明，在睡眠-觉醒周期中大脑区域内c-fos参与睡眠调节作用[18]。过氧化物酶体增殖物激活受体是一种新型类固醇受体，被其配体激活后可与特异的DNA反应元件结合，调控多种基因的转录和表达[19]。在大脑的神经元和星形胶质细胞以及脑血管内皮细胞都有表达，其中在额叶皮质层的所有层神经元、海马和杏仁核有高度表达[20]。NOS3参与精氨酸和脯氨酸代谢，并催化生成一氧化氮（NO），而NO是一种反应性自由基，在神经传递、抗菌和抗氧化等多种生理病理过程中起着生物调节剂的作用[21-22]。研究发现REM睡眠与大脑海马体细胞凋亡、成活的分子途径密切相关[23]。睡眠时间错误会破坏人类转录组的昼夜节律[24]，抑制与基因表达和翻译调控相关的基因，并增强与分解代谢过程相关的基因活性、ATP酶活性和过氧化物酶活性调控等。间歇性缺氧与睡眠密切相关，缺氧状态可修饰RNA聚合酶Ⅱ（特别在海马CA1区和前额叶皮层）调节基因表达[25]。多巴胺能突触[26]、5-HT能突触[27]在中枢神经系统（CNS）特别是睡眠节律调节中起着关键的作用。AMPK途径可抑制线粒体生物发生，增加细胞凋亡[28]，而AMPK是维持适当睡眠体系结构和睡眠剥夺后的睡眠恢复所必需的[29]。

本研究基于网络药理学和分子对接技术，构建和胃安神方治疗失眠“中药复方成分-疾病靶点-作用通路”的生物网络，发现和胃安神方中有19种有效成分，与失眠共有49个交集靶点，并涉及134条相关通路;结合文献分析和课题组前期基础实验，发现和胃安神方通过调节Th1/Th2平衡、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、脑源性神经营养因子（BDNF）及Bcl-2、Bax等细胞凋亡因子表达，参与治疗失眠的细胞凋亡等通路的机制调控[30-32]，初步验证了和胃安神方治疗失眠可能的药理、靶点、通路及分子机制，体现了中药组方多成分、多靶点、多途径的作用特点。由于和胃安神方组成和成分较复杂，后期将着重運用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱等现代药理学方法分析其主要活性成分的关键作用靶点和作用机制，为进一步实验验证、潜在药理学机制探索及临床拓展应用提供可靠的理论依据。

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（2021-02-15收稿 本文编辑：杨燕）