基于网络药理学和分子对接探讨补阳还五汤治疗糖尿病脑病的作用机制

李剑 张文风

摘要 目的：基于網络药理学方法和分子对接技术，探讨补阳还五汤有效成分治疗糖尿病脑病潜在作用机制。方法：从中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和中科院化学专业数据库筛选出补阳还五汤有效化学成分及其靶点，通过GeneCards、在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库收集糖尿病脑病靶点，运用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图并通过Cytoscape 3.8.0软件中CytoNCA插件筛选关键靶点。利用ClusterProfiler程序包进行基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，并通过Cytoscape 3.8.0软件构建补阳还五汤药物-成分-靶点-通路网络，最后利用AutoDock软件进行分子对接验证。结果：筛选得到补阳还五汤中活性成分108种，对应潜在靶点469个，网络图显示槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌等是补阳还五汤治疗糖尿病脑病的关键成分，蛋白激酶、P53蛋白、肿瘤坏死因子等是该方治疗糖尿病脑病的关键靶点。GO富集分析显示该方可能通过对氧化应激的反应、对药物的反应、对金属离子的反应等生物过程发挥作用，与膜筏、膜微域、膜区域等细胞组分有关，与酰胺结合、DNA结合转录因子结合、肽结合等分子功能有关。KEGG富集分析显示主要与PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路有关。分子对接结果表明补阳还五汤中主要活性成分与核心作用靶点具有较为稳定的结合活性。结论：本研究初步揭示了补阳还五汤多成分、多靶点、多通路治疗糖尿病脑病的机制，为补阳还五汤的临床开发利用提供了依据。

关键词 补阳还五汤;糖尿病脑病;网络药理学;分子对接;作用机制

Study on the Mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the Treatment of Diabetic Encephalopathy based on Network Pharmacology and Molecular Docking

LI Jian，ZHANG Wenfeng

（College of Basic Medicine，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of diabetic encephalopathy（DE） based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and targets of Buyang Huanwu Decoction were selected from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and Chemistry Database of Chinese Academy of Sciences（CAS）.The DE targets were collected from the GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）.STRING was used to construct the protein-protein interaction（PPI） network，and the plugin CytoNCA of Cytoscape 3.8.0 was employed to screen the key targets.The Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis were conducted by Clusterprofiler.The drug-component-target-pathway network was constructed by Cytoscape 3.8.0，and AutoDock was adopted for molecular docking.Results：A total of 108 active components of Buyang Huanwu Decoction were obtained，corresponding to 469 potential targets.The drug-component-target-pathway network showed that quercetin，glycine and senkyunone were the key components of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of DE，and protein kinase，P53 protein，and tumor necrosis factors were the key targets.GO enrichment analysis revealed that this prescription may exert the effect through processes such as acting on oxidative stress，drugs，and metal ions，involving the cell components of membrane raft，membrane microdomain and membrane region and the molecular functions of amide binding，DNA-transcription factor binding and peptide binding.KEGG enrichment analysis showed that PI3K-Akt and MAPK signaling pathways were mainly involved.Molecular docking indicated that the main active components in Buyang Huanwu Decoction had stable binding activity to the core action targets.Conclusion：This study revealed the mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of DE，and provided a basis for the clinical development and utilization of the prescription.

Keywords Buyang Huanwu Decoction; Diabetic encephalopathy; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.010

糖尿病脑病（Diabetic Encephalopathy，DE）是一种以大脑认知功能减弱为主要症状的糖尿病并发症[1]。根据其临床表现，可类属中医“消渴”并发“健忘”“痴呆”的范畴。消渴日久，内热炽盛，伤津耗气，气虚则推动血液运行无力，血液运行不畅，瘀血阻滞脑络，遂发为脑病。王永炎院士认为“毒损脑络”是DE的关键病机，解毒通络为基本法则[2]。经典名方补阳还五汤出自清代医家王清任的《医林改错》，原主治气虚血瘀之中风，具有补气活血通络的作用，为益气活血的代表方剂。基础研究显示该方所包含的活血化瘀中药可通过抑制海马神经元钙离子升高和凋亡，抑制胶质细胞的活化，改善血液流变学和微循环障碍，减轻氧化应激和炎症反应等机制，改善认知功能[3-8]。

因此，本研究采用网络药理学方法联合分子对接技术研究补阳还五汤治疗DE的潜在分子机制，以期为补阳还五汤的后续研究提供理论依据。

资料与方法

1. 补阳还五汤有效成分的收集与筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收集補阳还五汤中7味药物的化学成分，其中并未检索到地龙有效成分，故通过中科院化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn）进行补充检索，并按文献报道设定口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性值（Drug Likeness，DL）≥0.18，筛选符合条件的有效成分[9-10]。

1.2 补阳还五汤药材-有效成分-靶点网络的构建

通过TCMSP获取黄芪、桃仁、红花、赤芍、川芎、当归6味药有效成分所对应的靶点信息，同时利用中科院化学专业数据库补充检索地龙有效成分，并通过PubChem数据库获取地龙有效成分的SMILE号，采用SwissTargetPrediction数据库获取其靶点。将所有靶点合并、去重，并通过UniProt数据库对其名称标准化，然后利用Cytoscape 3.8.0软件，构建可视化网络。

1.3 疾病靶点的获取

利用在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、GeneCards数据库以“Diabetic Encephalopathy”为关键词搜索与糖尿病脑病相关发病机制靶点，2个数据库得到的靶点合并，并去掉重复的靶点，得到糖尿病脑病靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建

利用Venny 2.1.0绘制补阳还五汤与DE交集靶点韦恩图，将其导入STRING数据库中建立蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络，并利用Cytoscape 3.8.0软件中CytoNCA插件筛选关键靶点。

1.5 基因本体功能与京都基因和基因组百科全书通路富集分析

采用计算机R语言中clusterProfiler程序包对交集靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，并绘制气泡图进行可视化。GO包括生物过程，分子功能和细胞组分3个方面[11]。

1.6 分子对接验证

在PubChem中得到补阳还五汤中化合物的2D结构，并导入Chem3D软件得到优化后的3D结构;从PDB数据库中筛选得到的关键靶蛋白的3D结构“.pdb”格式文件，通过PYMOL软件去除了水分子和配体，分离蛋白结构。采用AutoDock软件并运用Grid模块设置蛋白原配体为对接盒子中心，其格点盒子大小设定为40×40×40，并对配体小分子可能发生作用的区域进行设定，利用AutoDock Vina分子模拟软件对药物小分子和靶蛋白受体进行分子对接分析。结合能小于-5.0 kcal/mol（ kcal=4 186 J）是分子对接时配体和受体稳定结合的标准，结合能越低分子结构稳定性越高[12]。

2 结果

2. 补阳还五汤有效成分及相关靶点的筛选

检索化合物数据及对应的靶点，其中赤芍29个、川芎7个、当归2个、红花22个、黄芪20个、桃仁23个，由于。地龙主要化合物均不满足OB≥30%和DL≥0.18的条件，故在此未列出地龙的相关数据。将所得化合物去重后共得到108个化合物。将所得靶点去重后共得到469个靶点。补阳还五汤主要化合物及其相关信息见表1。

2.2 构建补阳还五汤药材-有效成分-靶点网络

该网络图中共包括7个药材节点、84个有效成分节点和469个靶蛋白节点，共560个节点。见图1。

2.3 补阳还五汤靶点与DE靶点交集分析

合并去重得到DE靶点2 631个，将药材与疾病靶点映射后，共得到靶点245个。见图2。

2.4 构建交集靶点PPI网络

导入STRING数据库构建PPI网络图。见图3。通过Cytoscape 3.8.0插件CytoNCA对共有靶点进行拓扑分析，根据degree值大小筛选前20位关键靶点进行网络构建，得到关键靶点PPI网络图。见图4。根据网络间连线节点数目排列，得到PPI网络中核心靶点条形图。见图5。

2.5 GO富集分析 利用ClusterProfiler程序包进行GO功能富集分析，根据基因富集数目与显著程度，筛选各排名前10，通过R语言包绘制气泡图进行可视化处理。见图6。

其中生物过程主要涉及对金属离子的反应、对药物的反应、对氧化应激的回应、细胞对化学应激的反应、对营养水平的反应、对脂多糖的回应、对细菌起源的分子的反应、细胞对氧化应激的反应、老化、对活性氧类的回应等;细胞组分主要涉及膜筏、膜微区、膜区、囊泡腔、胞质囊腔、突触后膜、蛋白激酶复合物、质膜筏、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白依赖蛋白激酶全酶复合物等;分子功能主要涉及酰胺结合、DNA结合转录因子结合、肽结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子的结合、泛素样蛋白连接酶结合、羧酸结合、有机酸结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、氨基酸结合等。

2.6 KEGG富集分析

利用clusterProfiler程序包进行KEGG富集分析，筛选排名靠前的30条通路，通过R语言包绘制气泡图进行可视化处理。通路富集分析结果显示主要涉及PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、乙肝、MAPK信号通路、癌症中的蛋白质、流体剪切应力与动脉粥样硬化、人T细胞白血病病毒1感染、前列腺癌、丙型肝炎、肝细胞癌、EB病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞衰老、细胞凋亡、甲型流感、HIF-1信号通路、乳腺癌、胰腺癌、内分泌抵抗等。见图7。

2.7 药物-成分-靶点-通路的网络分析

该网络图中包括7个药材节点、84个有效成分节点、469个靶蛋白节点和20条通路节点，共580个节点。见图8。由网络图分析结果知，有效成分中连接边数较多的为槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素;潜在靶点中AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3连接较多边数;通路中如PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、乙肝、MAPK信号通路与潜在靶点有较多的连接。

2.8 分子对接结果

将药材成分中度值排名前5的槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素与度值排名前5的潜在靶点AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3进行分子对接分析。见表2，图9。对接结果显示活性成分与受体蛋白的最低结合能结果大部分小于-5.0 kcal/mol，说明活性成分与受体蛋白具有较好的结合活性，其中木犀草素和AKT1、TP53最低结合能最小，稳定性最高。分子对接模式见图10。

3 讨论

目前糖尿病脑病的发病机制较为复杂，尚未完全明确，本文基于网络药理学联合分子对接方法，构建了药材-有效成分-靶点网络、靶点蛋白PPI网络、药材-成分-靶点-通路网络，对补阳还五汤治疗糖尿病脑病的分子机制进行预测分析，为补阳还五汤的后续深入研究提供科学依据。

槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素等活性成分度值较高，在治疗过程中可能发挥重要作用。其中槲皮素能够提高高糖培养海马神经元活性，抑制海马神经元凋亡，其作用机制可能与内质网应激有关[13]。山柰酚可能是通过降低血糖，维持正常血脂水平，抗氧化、抗炎、降低醛糖酶途径，从而对2型糖尿病大鼠的心脑血管等慢性并发症产生保护作用[14]。木犀草素可以抑制海马神经细胞凋亡糖尿病脑病大鼠体内的细胞，其作用机制包括间接的抗氧化作用和抑制凋亡相关因子。另外，木犀草素激活磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT信号转导途径，并因此抑制海马神经细胞的凋亡[15]。

PPI网络拓扑学分析显示，AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3等为补阳还五汤治疗DE的潜在作用关键靶点。其中AKT1又称蛋白激酶B，对海马神经元细胞的生长及生存起重要的调控作用[16]。有证据表明，AKT1蛋白可能与2型糖尿病患者认知功能减退有关[17]。大脑AKT1磷酸化是胰岛素和其他生长因子信号转导中的关键节点[18]。TP53是一种抑癌基因，可参与葡萄糖等多种代谢途径[19]。醛糖还原酶通过激活TP53导致糖尿病介导的线粒体功能障碍和损伤[20]。肿瘤坏死因子（TNF）可促进细胞增殖和分化，并参与某些自身免疫病的病理损伤[21]。有研究表明，糖尿病脑病小鼠脑组织中小胶质细胞活化，TNF明显升高[22]。血管内皮生长因子A（VEGFA）在血管生成和内皮细胞生长中发挥重要作用，可以诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制细胞凋亡并诱导血管通透性等[23]。胱天蛋白酶-3（Caspase-3）是能够特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基上肽键的一种蛋白酶，在细胞凋亡过程发挥重要作用[24]。研究发现，海马区细胞凋亡是糖尿病脑病发病的重要因素[25]。

通路富集分析显示，补阳还五汤可能通过干预PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、乙肝、MAPK信号通路等治疗DE。刘昭前等[26]研究表明可通过抑制PI3K-AKT信号通路减轻炎症反应起到对糖尿病脑病大鼠模型的神经保护作用。Liu等[27]研究表明糖尿病性脑病中小胶质细胞的调节可能涉及MAPK信号通路，小胶质细胞-神经元的相互作用在糖尿病性脑病中起重要作用，而小胶质细胞活化的调节可能是糖尿病性脑病的治疗目标。

综上所述，补阳还五汤可能通过槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素等活性成分，作用于AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3等靶點，涉及PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染、乙肝、MAPK信号通路等机制来实现治疗DE的目的。本研究表明，补阳还五汤治疗DE呈现出多成分、多靶点、多通路的作用优势，为后续的细胞及动物实验研究和临床新药开发及应用提供思路和参考依据。

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（2021-02-18收稿 本文编辑：魏庆双）