消炎止痛膏巴布膏剂提取工艺优化

李 祥，安雅婷，周 淼

（天津市中医药研究院附属医院，天津 300120）

消炎止痛膏（津药制字Z20070286号）为天津市中医药研究院附属医院院内制剂，由木瓜、大黄、醋乳香、醋没药、蒲公英等7味中药组成。消炎止痛膏为外用软膏剂，涂敷于患处，应用于跌打损伤及疮疡肿毒，具有活血散瘀、清热消肿止痛的功效。消炎止痛膏在临床应用多年，安全有效，无明显不良反应，深受患者欢迎。消炎止痛膏中蒲公英是一种常见的中草药，富含多糖、咖啡酸、绿原酸、总黄酮等多种活性成分［1］。蒲公英能够清热解毒、活血止痛，现代药理研究表明，蒲公英具有广谱杀菌和抑菌作用，具有“天然抗生素”之美誉。这些药理作用与酚酸类物质有一定关系［2］。咖啡酸是蒲公英所含的主要成分之一，也是消炎止痛膏发挥药效的主要活性成份。

本文以咖啡酸提取率为评价指标，采用超高效液相色谱法测定咖啡酸含量，优化消炎止痛膏巴布膏剂提取工艺。

1 设备与材料

1.1 设备仪器 ACQUITY UPLCTMI-Class System超高效相色谱仪（美国Waters公司），HWS-150B恒温恒湿培养箱（中国北京市永光明医疗仪器有限公司），Smart2Pure超纯水仪（美国赛默飞公司），WGLL-125BE鼓风干燥箱（中国天津泰斯特公司），Sorvall Legend Micro 21微量离心机（美国赛默飞公司），AS62.R2十万分之一天平（波兰RADWAG公司），涡旋仪（中国江苏天翎仪器有限公司）。

1.2 试剂与药品 大黄（批号121200401，产地：青海，购于北京宏济药业有限公司），蒲公英（咖啡酸含量为337.43μg/g，批号21051511，产地：甘肃省天水市，购于安徽协和成药业饮片有限公司），木瓜（批号388210401，产地：安徽，购于北京宏济药业有限公司），栀子（批号585210401，产地：浙江，购于北京宏济药业有限公司），土鳖虫（批号2101012-01，产地：江苏，购于天津中药饮片厂有限公司），乳香（批号201203207，产地：埃塞俄比亚，购于天津市中药饮片厂有限公司），没药（批号2012068-03，产地：索马里，购于天津市中药饮片厂有限公司），上述药材经天津市中医药研究院附属医院孙浩主任中药师鉴定、药检室检测均符合《中国药典》2020年版［3］及《天津市中药饮片炮制规范》2018年版的要求；咖啡酸对照品（批号110885-201703，中国食品药品检定研究院）。甲酸、甲醇等均为分析纯，乙腈（天津康科德科技有限公司）为色谱纯，水为超净水。水提样品（S1，批号20121；S2，批号201214；S3，批号201215。均为本院制剂室提供），醇提样品（C1，批号201216；C2，批号201217；C3,批号201218。均为本院制剂室提供）。

2 制剂处方

大黄260 g、蒲公英100 g、木瓜100 g、土鳖虫46 g、乳香46 g、没药46 g、栀子46 g。

3 含量测定方法建立

3.1 溶液的制备

3.1.1 对照品溶液的制备 精密称量咖啡酸标准品适量，用甲醇将其定容至5 ml量瓶中，配置为浓度为1.02 mg/ml对照品溶液。

3.1.2 供试品溶液的制备 水提液以甲醇稀释2倍后，以10 000 r/min转速离心，取上清液，过0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液；醇提液以乙醇渗漉样品溶液100 ml浓缩后以甲醇定容于25 ml量瓶中，以10 000 r/min转速离心，取上清液，过0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液。

3.1.3 阴性样品溶液的制备 取不含蒲公英提取液适量，置量瓶中加5%甲醇水溶液至刻度。

3.2 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）色谱柱，柱温：45℃，样品室温度：4℃，进样体积：2μl，流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序如表1所示。流速：0.3 ml/min。检测波长：320 nm。在此色谱条件下，咖啡酸与其他成分可以有效地进行分离，阴性样品对测定无干扰。见图1。

表1 梯度洗脱程序

图1 对照品（A）水提供试品（B）醇提供试品（C）阴性样品（D）UPLC色谱图

3.3 标准曲线的建立 精密量取“3.1.1”项下对照品溶液，将其稀释为不同浓度梯度的标准溶液。以浓度为X轴，峰面积为Y轴绘制标准曲线。线性回归方程为Y=36 652.543 1 X-5 463.025 4（r=0.999 9）。在0~70μg/ml浓度范围内线性关系良好。

3.4 精密度试验 精密吸取“3.1.1”项下对照品溶液，重复进样6次，在上述色谱条件下测定，计算峰面积RSD值为0.20%，表明精密度良好。

3.5 稳定性考查 精密取同一份样品，按“3.1.2”制备供试品溶液，于处理后0、2、4、6、8、12和24 h分别进样，在上述色谱条件下测定，计算峰面积RSD值为0.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.6 重复性试验 精密吸取同一批样品，按“3.1.2”制备供试品溶液，平行6份，处理后在上述色谱条件下测定，分别进样5μl测定，RSD值为0.44%，表明该方法重复性良好。

3.7 加样回收率试验 精密吸取已知含量的样品，平行6份，精密加入对照品溶液1 ml，按“3.1.2”制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定，平均回收率为88.04%，RSD值为2.95%，表明该方法准确度良好。方法验证数据表明，建立的咖啡酸含量测定方法可行。加样回收率结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

4 提取方法

4.1 水提工艺 取蒲公英100 g，按处方量将7味饮片加适量水浸泡后，再加适量水，煎煮，合并煎液过滤。

4.2 醇提工艺 取蒲公英100 g，按处方量将7味饮片加不同浓度乙醇溶液浸泡后，过滤。

5 提取工艺优化

5.1 水提工艺正交设计 确定浸泡时间（A）、煎煮次数（B）、煎煮时间（C）、加水量（D）作为影响因素，采用4因素3水平正交试验进行工艺优化，因素水平见表3，结果见表4。从试验结果可见，4个因素对综合评分的影响大小分别为：煎煮次数（B）＞加水量（D）＞煎煮时间（C）＞浸泡时间（A），最佳成型工艺参数为A2B3C2D2，即浸泡2 h、煎煮3次、每次煎煮2 h、加8倍量的水。

表3 因素水平

表4 正交设计与结果

5.2 乙醇浸提法工艺优化 确定浸泡时间（A）、乙醇浓度（B）、液料比（C）作为影响因素，采用3因素3水平正交试验进行工艺优化，因素水平见表5，结果见表6。从试验结果可见，3个因素对综合评分的影响大小分别为：浸泡时间（A）＞乙醇浓度（B）＞液料比（C），最佳成型工艺参数为A3B3C2，即浸泡72 h、加8倍量90%的乙醇。

表5 因素水平

表6 正交设计与结果

5.3 两种最佳提取工艺的比较 按两种提取方法分别确定的最佳工艺所得3批样品，测定咖啡酸含量，结果水提工艺的咖啡酸提取率高于乙醇浸提法。见表7。两种工艺比较结果表明，水提工艺的咖啡酸提取率高于乙醇浸提法，故确定水提工艺为消炎止痛膏巴布膏剂提取工艺。其影响因素顺序依次为：煎煮次数＞加水量＞煎煮时间＞浸泡时间；采用提取方法为加8倍量的水，浸泡2 h，煎煮3次，每次煎煮2 h。

表7 两种提取方法最佳提取工艺咖啡酸含量比较

6 讨论

6.1 浸泡时间 干燥饮片若不先用清水浸泡而直接以急火煎煮，会使药材表面所含的蛋白质凝固，淀粉糊化，甚至阻塞药材的毛细管孔隙，造成中药材里有效成分不易溶出。在煎煮之前应用清水浸泡一段时间，使药材因吸足水分而软化，细胞膨胀，有效成分逐渐溶解进入水中。这样再进行煎煮，随着水温逐渐升高，细胞进一步膨胀，药材的有效成分就能更快、更完全的溶解在药液当中，增进汤剂的疗效。本研究通过正交实验表明，消炎止痛膏巴布膏剂的浸泡时间为2 h。

6.2 测定方法 本研究中采用UPLC方法建立了消炎止痛膏巴布膏剂中咖啡酸含量测定的方法。UPLC方法因为其色谱柱填料粒径更小（1.7μm）、检测器采样速度快等原因，其相比传统的高效液相色谱法具有高分离度、高速度以及高灵敏度的优势。在本试验中，UPLC的使用提高了分离度，改善了峰形，且极大的提高了样品分析效率。

6.3 提取方法筛选 本研究采用了水及不同浓度的乙醇对消炎止痛膏处方进行提取，由于消炎止痛膏处方中含有乳香、没药，二者均为树脂类药物，其在乙醇体系中有效成分难以溶出，因此，本研究在中医药理论指导下，考虑到中药复方的疗效为多种药物协同发挥作用，乳香［4-6］及没药［7］作为活血止痛药是本方的重要组成药物，因此选择水为提取溶剂。