基于指纹图谱和体外抗胰脂肪酶活性的硫熏山楂饮片质量分析

高利兴，戴衍朋，石典花，周 倩

（1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250；2.山东省中医药研究院，山东 250014；3.国家中医药管理局中药蜜制和制炭炮制技术与原理重点研究室，山东 250014）

山楂为蔷薇科植物山里红Cralaegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果实［1］，自古药食两用，有消食化积，健脾开胃的功效［2］。山楂的药用价值很高，不仅可以调节动物体内脂代谢，还具有保护心血管系统、抗氧化、抗肿瘤等作用［3］。硫磺熏蒸具有增白、防潮、防虫的功效，但过度硫磺熏蒸不仅会导致药材残留二氧化硫等有毒有害物质超标，而且会对中药成分产生较大影响，如白芷［4］、苦杏仁［5］、浙贝［6］、西洋参［7］等均有报道。同时过度硫熏的药材不仅无法产生应有的疗效，反而会产生毒副反应，从而影响其疗效。因此《中国药典》2020版明确规定10个品种的中药饮片可以用适量的硫磺熏制，这10个品种是天麻、白及、山药、天冬、牛膝、白芍、粉葛、天花粉、白术、党参，而且明确规定了硫磺处理后的药品二氧化硫残留限量为不得超过400 mg/kg，《中国药典》未做规定的品种其二氧化硫残留限量为不能超过150 mg/kg。为了考查硫磺熏蒸对山楂质量的影响，本文制备了同一来源的多批次烘干和硫熏山楂饮片，进行了指纹图谱分析和抑制胰脂肪酶活性测定，为山楂饮片质量标准制定提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料 山楂鲜果（13批）；金丝桃苷对照品（批号

PRF10052541，购于成都普瑞法科技开发有限公司）；乙腈（色谱纯，购于默克公司），磷酸（色谱纯，购于天津科密欧）；胰脂肪酶（PL）购于合肥博美生物科技有限公司，奥利司他（Orlistat）购于上海源叶生物科技有限公司，对硝基苯基丁酸酯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三羟甲基氨基甲烷、二甲基亚砜、乙腈、升华硫、过氧化氢、氢氧化钠、甲基红均为市售分析纯。

1.2 仪器 1100型高效液相色谱仪（Agilent）；DKS22电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），Multiskan FC酶标仪（Thermo Scientitic），TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器），PHS-3E pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司），涡旋混匀器（广州艾卡仪器设备有限公司），96孔板（NEST生物科技），移液枪（Eppendorf）。

2 方法与结果

2.1 山楂指纹图谱研究

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ThermoSyncronisC18（250mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；进样量：10 μl；检测波长：203 nm［1］。

2.1.2 山楂饮片的制备 取山楂鲜果，除去果核，切5～7 mm厚的片，平铺于筛网上，置热风循环烘箱内，60℃烘干，得烘干品。取山楂鲜果，除去果核，切5～7 mm厚的片，平铺于筛网上，置自制硫熏棚内，点燃硫磺，熏蒸5 min，然后再置热风循环烘箱内，60℃烘干，得硫熏品。

2.1.3 溶液制备

2.1.3.1 供试品溶液的制备 取山楂饮片粉末（过40目筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水20 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，14 000×g离心10 min，取上清液即得［3］。

2.1.3.2 对照品溶液的制备 取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.4 精密度试验 取山楂1号样品的供试品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，根据所得指纹图谱计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果各色谱峰的相对保留时间RSD为0.83%，相对峰面积RSD＜1.52%，表明精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取山楂1号样品的供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12和24 h进样，根据所得指纹图谱计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果各色谱峰的相对保留时间RSD＜2.17%，相对峰面积RSD＜1.98%，表明稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 称取山楂1号供试品5份，按照供试品的制备方法制备成供试品溶液，按上述色谱条件进样，根据所得指纹图谱计算各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果各色谱峰的相对保留时间RSD＜2.77%，相对峰面积RSD＜2.90%，表明重复性良好。

2.2 山楂饮片指纹图谱构建和相似度评价

2.2.1 共有峰的标识 按照供试品溶液的制备方法将13批烘干山楂饮片制备供试品溶液，并按上述色谱条件进样，得到S1-S13供试品溶液的HPLC指纹图谱。将HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会2004版）”，经过分析，选择19个共有色谱峰作为其特征峰，13批山楂饮片的指纹图谱的主要色谱峰峰形基本一致，见图1和图2。以金丝桃苷色谱峰为参照峰，对各主要色谱峰进行统计，结果表明各色谱峰的峰面积存在一定的差异，见表2。

表2 13批烘干山楂饮片共有峰的保留时间和相对峰面积

图1 烘干山楂样品的HPLC特征图谱峰

图2 13批烘干山楂样品的HPLC叠加图

按照供试品溶液的制备方法将13批硫熏山楂饮片制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，得到S1-S13供试品溶液的HPLC指纹图谱。同上方法进行分析，同样选择19个共有色谱峰作为特征峰，13批硫熏山楂饮片的指纹图谱的主要色谱峰峰形基本一致，见图3和图4。以金丝桃苷色谱峰为参照峰，对各主要色谱峰进行统计，结果表明各色谱峰的峰面积存在一定的差异，见表3。

表3 13批硫熏山楂饮片共有峰的保留时间和相对峰面积

图3 硫熏山楂样品的HPLC特征图谱

图4 13批硫熏山楂样品的HPLC叠加图

2.2.2 相似度计算 使用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度计算，首先将13批烘干山楂和13批硫熏山楂饮片的图谱数据逐条导入，生成对照图谱，经过多点校正，色谱峰匹配，计算平均数相似度。13批烘干山楂饮片指纹图谱相似度较高，均在0.95以上，可见山楂饮片的质量在不同时间、地点采集的差异不大，见表4。13批硫熏山楂饮片中，第3批和第11批相似度低于0.9，其他各批均高于0.95，见表5。

表4 13批烘干山楂饮片指纹图谱相似度评价结果

表5 13批硫熏山楂饮片指纹图谱相似度评价结果

2.2.3 山楂烘干品和硫熏品特征指纹图谱的比较 直观观察山楂烘干品和硫熏品特征图谱，发现二者在峰形、峰数等方面，差异较小，见图5。

将山楂烘干品和硫熏品特征图谱同时导入指纹图谱相似度评价软件，分析结果二者相似度可达0.992，表明山楂烘干品和硫熏品二者在指纹图谱的色谱峰数据差异较小。将13批烘干山楂的特征图谱以及硫熏山楂的HPLC指纹图谱导入指纹图谱相似度评价软件进行检验分析，13批硫熏样品中仅有3号和11号饮片与烘干样品的相似度＜0.90，其他各批样品相似度均＞0.90，见表6。

表6 13批硫熏山楂饮片与烘干山楂饮片特征图谱的相似度评价结果

2.3 胰脂肪酶抑制活性测定

2.3.1 山楂饮片提取液制备 取山楂饮片约5.0 g，加水50 ml，加热回流2次，每次30 min，滤过，合并滤液，浓缩至50 ml，得生药质量浓度为100 mg/ml的水提液。

2.3.2 山楂样品制备 水提液10 000×g离心10 min，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液［4］稀释到质量浓度为50 mg/ml后，再使用二甲基亚砜（DMSO）［5］逐级稀释，得到质量浓度为10 mg/ml的样品。

2.3.3 胰脂肪酶溶液（PL）制备 精密称取适量的胰脂肪酶粉末，使用磷酸盐（PBS）缓冲液［6］配制成质量浓度为1 mg/L的粗酶液，10 000×g离心5 min，再取上清液，现配现使用。

2.3.4 对硝基苯基丁酸酯（pNPB）溶液［7］（底物）配制 使用移液枪吸取18μl pNPB溶液于10 ml量瓶中，再用乙腈定容，获得浓度为10 mmol/L的溶液，置于4℃环境下保存备用。

2.3.5 胰脂肪酶抑制率测定方法 在1.5 ml离心管（EP管）［8］中加入抑制剂（或Tris-HCl）与酶于37℃下孵育10 min，加入150μl底物，混匀，孵育5 min。取150μl于96孔板中，于405 nm下测定吸光度。每个实验重复3次，最终求得所得结果的平均值。各组加入量见表7。

表7 反应体系各组所加试剂及用量 μl

胰脂肪酶抑制率（%）=［1-（B-b）/（A-a）］×100%［9-10］

其中，A为未添加抑制剂酶的活性，a是其空白对照（未加酶）；B是加入抑制剂的酶的活性，b是其阴性对照（未加酶）。

2.3.6 山楂样品抑制胰脂肪酶活性测定 以质量浓度为10 mg/ml的山楂水提液样品作为胰脂肪酶抑制剂，测得山楂烘干品和硫熏品抑制率。结果烘干品的抑制率为35.31%～56.33%，硫熏品的抑制率为15.97%～30.61%，二者具有极显著差异（P＜0.001）。见表8。

表8 山楂烘干品与硫熏品胰脂肪酶抑制率

2.4 硫熏山楂的二氧化硫残留测定 照《中国药典》二氧化硫残留量测定法（通则2331）［9］第一法（酸碱滴定法）对13批硫熏山楂进行测定，结果经硫熏后的山楂片二氧化硫残留量为15.97～30.61μg/g，均符合《中国药典》不得超过150μg/g的规定。结果见表9。

表9 山楂硫熏品二氧化硫残留含量（n=2）

3 讨论与小结

在中药材进行加工干燥时一些易腐烂变质、不易干燥的中药材一般都采用硫磺熏蒸干燥法。硫磺不完全燃烧产生二氧化硫，能使中药色泽鲜艳，并能达到防虫、杀菌、防霉、增白等效果，本课题组在山楂的产地调研中发现，为追求山楂饮片外形的美观，山楂鲜果切制后常使用硫磺熏蒸5～10 min，然后再进行干燥，也可以减少流通、贮藏中发生霉变、虫蛀等，而且短时间熏蒸后，二氧化硫残留符合《中国药典》规定。

目前常用于硫磺熏蒸对中药成分影响的分析方法有HPLC指纹图谱法［4，8］、薄层色谱法［9］等。本文采用HPLC指纹图谱的方法，对烘干山楂和硫熏山楂进行了化学成分的对比，结果表明二者的成分变化比较小，其原因可能是山楂熏蒸的时间远远小于山药等品种的熏制时间。同时也说明，HPLC指纹图谱的方法无法对硫熏和非硫熏山楂进行判别。

由胰腺分泌出的胰脂肪酶是食物脂肪水解过程中的主要酶类，能够代谢50%～70%的甘油三脂，抑制胰脂肪酶活性可有效抑制脂肪的水解和吸收，可以达到控制和治疗肥胖和脂质代谢紊乱的目的［10-12］。本课题组经过前期研究发现，山楂水提取物具有较好的抑制胰脂肪酶活性的作用［13］，大鼠动物实验也表明［14］山楂具有较好的预防营养过剩造成的肥胖的作用。因此采用体外抑制胰脂肪酶活性的方法，对山楂烘干品和硫熏品进行了对比分析。采用SPSS软件对两种处理方式山楂饮片的胰脂肪酶抑制率进行对比分析，烘干品的抑制率为（46.07±5.89）%，硫熏品为（25.42±4.99）%。烘干和硫熏山楂样品进行t检验，结果表明，烘干法制备的山楂样品胰脂肪酶抑制活性显著高于硫熏品。

综合HPLC指纹图谱和体外抑制胰脂肪酶活性实验研究发现，硫熏山楂虽然熏制时间仅5～10 min，其化学成分也未发生显著变化，二氧化硫残留量符合《中国药典》规定，但其药理活性却显著降低，表明硫磺熏蒸对中药的药效产生了较大的负面影响，建议在山楂的加工干燥过程中尽量不采用硫磺熏蒸的加工方法。