温经汤“异病同治”痛经、子宫内膜异位症和月经不调的网络药理学作用机制研究

杨梦雅，刘 杨，田 野，李瑞明*

（1.中国药科大学中药学院，江苏 210009；2.天士力控股集团有限公司研究院现代中药开发中心，天津 300410；3.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410）

温经汤最早出自于张仲景的《金匮要略》，《妇人大全良方》中的温经汤则是根据《金匮要略》原方加减而来［1］，全方由川芎、当归、肉桂、白芍、人参、牡丹皮、牛膝、莪术、甘草9味药组成。该方具有温经散寒，通利血脉，活血祛瘀，调经止痛的功效［2］。古代经典名方目录（第一批）中包含100首方剂，温经汤是百首之一，同时也是古代经典名方关键信息表中公布的7首方剂之一。

VOSviewer软件可用于构建和可视化从大量科学文献中提取的重要术语的共发生网络。利用VOSviewer软件对温经汤的临床应用文献进行分析，探讨其临床应用特点。

“异病同治”思想源自黄帝内经，中医认识疾病和治疗疾病的基本原则是辨证论治，异病同治的根本是“证同治亦同”，也是辨证论治的实质体现［3］。网络药理学利用多种方法，包括网络可视化技术、高通量技术、网络分析技术等，通过探索与中医复方治疗疾病相关的作用机制，可以从整体上来描述复方与机体之间的相互作用，从而表明“复方-多成分-多靶点-疾病”的网络关系［4］。复方中药具有多途径、多成分、多靶点等协同作用的特点，而且由于其药效物质基础和作用的机制比较复杂，所以不管是在整体上还是细胞以及分子水平上，都很难进行全面系统的研究［5］。网络药理学就是通过药物-基因-疾病的共模块分析来说明复方中药方剂配伍的，有助于中药“异病同治”科学内涵的阐释。

本研究用VOSviewer软件可视化分析温经汤的临床应用，采用网络药理学系统分析方法，对温经汤治疗痛经、子宫内膜异位症和月经不调的有效成分、作用靶点、作用机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 数据库及软件 中药系统药理学数据库和分析平 台 TCMSP（https://old.tcmspe.com/tcmsp.php）；Uniprot数 据 库（https://www.uniprot.org/）；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；DrugBank数据库（https://go.drugbank.com/）；Disgenet数 据 库（https://www.disgenet.org/）；David（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）数据库；CNKI数据库（https://www.cnki.net/）；Cytoscape 3.7.1软件；STRING数据库（https://www.string-db.org/）；Venny 2.1网页（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）；VOSviewer软件。

1.2 利用VOSviewer软件统计分析 检索中国知网数据库（CNKI），以“温经汤”“加减温经汤”为主题词精确搜索，时间范围限定在2000年—2021年5月，筛除动物实验、综述等文献，统一关键词表达方式。将题录信息导入到VOSviewer中绘图，设置关键词出现次数≥5，计数方式为“Fractional counting”。

1.3 活性化合物及其作用靶点信息 以肉桂、人参、川芎、当归、莪术、牛膝、牡丹皮、白芍和甘草9味药材名为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台中筛选出温经汤中9味药材的化学成分，将药物生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，筛选检索到的化学成分，同时，结合检索知网和万方等中文数据库对有效活性成分进行补充完善。整理已获得的靶点蛋白将其导入到Uniprot数据库，将已获得靶点蛋白与基因名进行转换。对靶点进行筛选和校正，选择物种为“human”，将所有的基因校正为官方名称。

1.4 温经汤治疗痛经、子宫内膜异位症和月经不调的共同靶点查询 利用GeneCards数据库、Disgenet数据库以及DrugBank数据库，得到痛经（dysmenorrhea）、子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）和月经不调（menstrual disorder/irregularities）的潜在靶点。将3种疾病的靶点与温经汤中活性成分所对应的靶点取交集，得到温经汤治疗痛经、子宫内膜异位症和月经不调的共同作用靶点。

1.5 潜在共有靶点的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建 将潜在共同作用靶点导入STRING数据库，选择Multiple proteins并限定物种为Homo sapiens，构建共同作用靶点的PPI网络。再将其导入到软件Cytoscape 3.7.1中，实现可视化。

1.6 GO富集和KEGG通路分析 将上述获得的核心靶点输入David数据库，Select Identifier选择为OFFICIAL-GENE-SYMBOL，List Type选择为Gene List。选择物种为Homo sapiens进行KEGG通路和GO功能富集分析。

1.7 温经汤“异病同治”活性成分-靶点-关键通路网络图的构建 把温经汤“异病同治”的KEGG通路和相关靶点反向对接活性化合物，通过Cytoscape 3.7.1软件构建相关网络图。

2 结果

2.1 VOSviewer统计分析结果 对检索到的文献进行筛选，去除综述、动物实验以及不相关的文献，共获得277篇文献，统一关键词表达方式，例如“the wenjing decoction”和“wenjing decoction”统一为“温经汤”，“primary dysmenorrhea”和“dysmenorrhea”统一为“痛经”，“寒凝血瘀证”和“寒凝血瘀型”统一为“寒凝血瘀”。“中医药疗法”更改为“中医药治疗”，“疗效观察”更改为“疗效”等。将文献导入到VOSviewer中绘图，设置关键词出现次数≥5，计数方式为“Fractional counting”，结果如图1所示。从图可看出温经汤在临床上主要用于治疗痛经、子宫内膜异位症、月经不调和不孕等妇科疾病。

图1 VOSviewer关键词共现聚类视图

2.2 温经汤候选活性化合物的筛选及靶标预测 通过TCMSP数据库对温经汤中9味中药进行检索，筛选条件是OB≥30%和DL≥0.18，去除没有靶点的化学成分，同时结合文献检索补充相关活性成分。共得到173个活性成分，其中白芍8个、莪术2个、牡丹皮7个、牛膝17个、川芎6个、肉桂14个、人参28个、当归3个、甘草88个。将整理搜集到候选活性成分的靶点导入Uniprot数据库，对搜集筛选得到的靶点蛋白进行筛选和校正，将9味药材的靶点合并去重共得到302个靶点。见表1。

表1 温经汤经筛选获得的173个候选活性化合物基本信息

续表1 温经汤经筛选获得的173个候选活性化合物基本信息

续表1 温经汤经筛选获得的173个候选活性化合物基本信息

续表1 温经汤经筛选获得的173个候选活性化合物基本信息

2.3 温经汤“中药-活性化合物-靶标”网络构建 将9味中药、173个活性化合物与对应的302个基因靶点导入Cytoscape 3.7.1，绘制“药材-活性化合物靶点”网络（图2）。网络共466个节点，3 370条边。

图2 温经汤“中药-活性化合物-靶标”网络

2.4 温经汤治疗痛经、子宫内膜异位症和月经不调的潜在靶点分析 通过检索GeneCards数据库、Drug－Bank数据库以及Disgenet数据库，在GeneCards数据库检索出子宫内膜异位症1 783个靶点，取相关性得分大于中位数的靶点有906个。月经不调有2 720个靶点，取相关性得分大于中位数的靶点有1 360个。痛经有240个靶点。合并3个数据库检索到的疾病靶点去重后分别获取痛经373个靶点、子宫内膜异位症1518个靶点和月经不调1 382个靶点。通过使用Venny软件工具把上面3个疾病靶点分别与温经汤活性化合物调控的靶标取交集，绘制出韦恩图（图3），得到了61个温经汤调控3种疾病的共有靶标。另外，80个与痛经调控相关的潜在靶标，151个与子宫内膜异位症调控相关的潜在靶标，157个与月经不调调控相关的潜在靶标。

图3 温经汤与痛经、子宫内膜异位症和月经不调的靶点交集韦恩图

2.5 温经汤调控3种疾病的共有靶标PPI网络构建 把这61个温经汤调控3种疾病的共有靶标导入STRING来进行PPI网络分析，再使用Cytoscape 3.7.1可视化图像（图4）。61个节点，860条边在图中。以节点表示蛋白，节点间的相互作用用边表示。图示中节点度值与颜色和节点有关，颜色越深，节点越大，表示的节点值就越大，得到这些共有靶标的平均节点度值是30，有28个蛋白靶标超过该值。其中ESR1、MAPK3、TP53、PTGS2、VEGFA、TNF、AKT1、IL6，degree值显著高于其余靶点，在PPI网络中起着重要的纽带作用。

图4 共有靶点的PPI网络图

2.6 GO与KEGG富集分析 将上述获得的温经汤治疗痛经、子宫内膜异位症和月经不调的潜在核心靶点输入David数据库进行KEGG通路和GO功能富集分析。KEGG通路共有98条，温经汤“异病同治”的主要信号通路选择P值最小的前15条信号通路，见图5A。这些通路主要包括癌症（pathwaysin cancer）、肿瘤坏死因子信号通路（TNFsignaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、子宫内膜癌（eEndometrial cancer）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）等。生物过程（BP）条目计284项，将其中P值最小的前15项进行气泡图绘制，见图5B。生物过程主要涉及炎症反应、血管再生、信号转导、激素应答等。

图5 GO功能（A）与KEGG通路（B）富集分析

2.7 温经汤“异病同治”活性成分-靶点-信号通路网络图构建 将温经汤“异病同治”的活性成分、潜在作用靶点及KEGG筛选出来的前15条信号通路一一对应，制作温经汤“异病同治”活性成分-靶点-信号通路图（见图6）。根据通路图中排名前15的活性化合物度值，筛选出活性成分槲皮素、山柰酚、黄芩素、柚皮素、芹菜素等可能是温经汤“异病同治”的主要活性成分。主要涉及的靶点包括PTGS2、ESR1、PPARG、NOS3、AKT1、CASP3、TNF等。

图6 活性成分-核心靶点-通路图

3 讨论

温经汤是治疗妇科疾病的经典名方，通过VOSviewer软件可视化分析，总结出在临床应用中，主要用于治疗痛经、月经不调、子宫内膜异位症和月经病等妇科疾病。

在临床上子宫内膜异位症的症状为痛经和月经不调［6］。子宫内膜异位症、痛经和月经不调三者病理状态相互联系，病证相互促进，三者在治疗方案上也有着一定的相似性。因此，研究温经汤对子宫内膜异位症、痛经和月经不调三者的异病同治机制，为后续深入研究温经汤发挥药效作用的物质基础提供了依据，同时为中医“异病同治”提供理论依据。

温经汤“异病同治”的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚、黄芩素、柚皮素、芹菜素等。槲皮素最有效的作用之一是调节炎症。槲皮素的抗炎作用是通过抑制炎症酶环氧合酶（COX）和脂氧合酶，从而减少炎症介质［7］。在体外，利用槲皮素处理脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞瘤系细胞炎症模型，槲皮素显示出较好的抗炎效果，是通过降低炎症因子IL-1、IL-6、IL-10的表达量［8］。山柰酚可降低促炎细胞因子的产生和mRNA表达，在细胞层面此抗炎作用也得到了证实［9］。黄芩素的药理作用是抗炎，增强免疫和抗肿瘤。研究表明，黄芩素可抑制炎性递质前列腺素E2（PGE2）、NO的凋亡，改善环氧化物酶-2（COX-2）蛋白表达水平，且抗炎效果和药物浓度呈一定程度的正相关。并且黄芩素也可对肿瘤增殖、生长等机制产生抑制作用。

本研究筛选出温经汤异病同治的潜在作用靶点包括PTGS2、ESR1、NOS3、AKT1、CASP3、TNF等，其中雌激素受体（ESR1），介导大部分的雌激素反应。子宫内膜异位症（endometriosis）是一种常见的妇科疾病，其依赖于雌激素，雌二醇（estradiol，E2）作为一种雌激素，能够促进异位病灶细胞的黏附、侵袭、增殖、抑制凋亡以及维持炎性反应［10］。因此通过调节体内雌激素的水平可有效治疗子宫内膜异位症、痛经和月经不调［11-12］。肿瘤坏死因子（TNF）是一类能够参与多种生物效应的细胞因子，其通过结合细胞膜上的受体来激活TNF信号通路，以此来调控细胞的生长、分化、调亡及诱发炎症等过程，另外对新生血管生成也有一定的潜在诱导作用［13］。研究表明，内膜异位有可能会刺激机体产生相关的免疫反应，导致腹腔液白细胞中的巨噬细胞大量增加，从而诱发其产生较多的TNF-α因子，促进间质细胞的黏附和增殖，最终导致异位病灶［14］。

温经汤中中医异病同治主要涉及到癌症信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll样受体信号通路、子宫内膜癌、HIF-1信号通路、雌激素信号通路等。子宫内膜异位症虽然在病理组织学上呈现出良性肿瘤的状态，但其具有恶性肿瘤的特点，如调节子宫内膜细胞的迁移、黏附和生成新生血管等［15］。病理学研究认为，非典型的子宫内膜异位症是良性的子宫内膜异位症到癌症的一个过渡，所以子宫内膜异位症其实就是卵巢癌的癌前状态［16］。有研究［17］发现EMT患者异位子宫内膜以及血清中肿瘤坏死因子、白细胞介素-1β等炎症因子水平升高，通过控制这些炎症因子水平有利于EMT的治疗。Toll样受体信号通路可能参与调节EMT的发生、发展［18］。

Rashidi等［19］通过分析15例患者体内的子宫内膜组织，证明了TLR4蛋白在子宫内膜的间质细胞及内膜上皮细胞中都有表达，而且子宫内膜的间质细胞中蛋白表达水平比子宫内膜上皮细胞要高，表明TLR4蛋白可能参与对子宫内膜中的免疫反应调节。在分子细胞方面，Khan等［20］发现子宫内膜异位症患者腹腔液白细胞中的巨噬细胞分泌的炎症细胞因子（如TNF-α、IL-6等）在雌激素和LPS的联合作用下显著增加，并且发现在该作用下使得培养的在位和异位子宫内膜细胞显著增多。但是当阻断了雌激素受体与TLR4的作用后，明显抑制了炎症细胞因子的分泌及子宫内膜细胞的生长。这表明了雌激素和TLR4信号通路的联合有助于促进盆腔炎性反应，促进子宫内膜异位细胞的生长。缺氧诱导因子-1α是HIF-1信号通路中在机体缺氧条件下关键应答调节转录因子，通过调控血管生成素、血管内皮生长因子、血小板生长因子等的表达，对异位子宫内膜的血管生成发挥重要作用［21］。

Goteri等［22］通过对子宫内膜异位症患者异位灶局部的检测，发现HIF-1α的表达量明显高于正常子宫内膜组织。结果表明内膜异位症的发生发展和血管的生成及促血管因子表达的上调密切相关，HIF-1α可能参与了其中的一些促进作用。相关研究［23］证实HIF-1α在多种病理过程中发挥很大作用，如肿瘤的血管生成、侵袭和转移等。子宫内膜异位症即使属于良性的疾病，但是其增殖、浸润、转移及复发等病理学行为与恶性肿瘤极为相似，所以HIF-1α在子宫内膜异位症中的作用也得到更多的关注。在黄体中期雌二醇高峰能够促进月经前期子宫内膜中PGF2α的生成；孕激素（progesterone，P）可以把雌二醇转化为没有活性的雌酮，通过降低PG的合成和子宫平滑肌的舒缩活性来缓解痛经。国内有相关研究表明雌激素和孕激素与其受体结合，可以激活血清中的肥大细胞释放致痛的物质，与痛经的发生相关［24］。病灶局部中高雌激素和雌激素受体会导致异位组织的细胞在增殖、凋亡、黏附、侵袭、血管新生和炎性反应等多方面发生异常，对发生发展子宫内膜异位症十分有利［25］。

本研究通过网络药理学直观表现了温经汤“异病同治”作用是通过多成分、多靶点的方式发挥其功效，为进一步实验验证和临床应用提供了理论依据。