甘草泻心汤配方颗粒与传统汤剂HPLC指纹图谱一致性研究

何 颖，邹爱英*，涂正伟，刘慧敏

（1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250；2.天津市南开医院，天津市急腹症器官损伤与中西医修复重点实验室，天津 300100；3.深圳市宝安纯中医治疗医院，广东 518000）

甘草泻心汤始载于《伤寒杂病论》，由甘草四两（炙）、黄芩三两、干姜三两、半夏半升（洗）、大枣十二枚（擘）、黄连一两组成，主要用治误下所致脾胃损伤严重，胃虚气逆致心下痞证［1］。现代药理研究表明，其具有抗炎［2-4］、抗溃疡［5］、抑菌［6］等药理作用；在治疗溃疡性结肠炎［7］、口腔溃疡［8］及部分自身免疫疾病［9］等方面均有较好疗效。

中药传统汤剂具有组方灵活、可随证加减的优点，其应用传承至今。但随着现代生活节奏的加快，中药传统汤剂因其煎煮费时、不易储存、携带不便等缺点，制约了其在临床的使用与发展。中药配方颗粒是用符合炮制规范的传统中药饮片做原料，经过提取、浓缩、分离、干燥、制粒、包装等现代化制药技术制成的单味中药颗粒剂［10］，具有剂量准确、易携带、服用方便、可提高患者用药依从性等优势，在一定程度上推动了传统剂型的改革与创新。但中药传统汤剂的共煎过程是否对其物质基础产生影响，中药配方颗粒组成的复方汤剂与传统汤剂是否存在物质基础上的差异的困惑，是摆在中药配方颗粒汤剂推广应用一个亟需解决的问题。建立中药指纹图谱能较为全面地反映药材中所含化学成分的种类与数量，其整体性和模糊性的特点适于对中药质量进行整体描述和评价［11］。化学计量学的引入进而将中药复杂的多成分鉴别转化为对数据的解析，达到定性与定量研究的目的［12］，指纹图谱结合化学计量学评价的中药质量评价方法在中药质量研究领域得到了大量的应用［13-15］。本试验以甘草泻心汤为研究对象，通过比较配方颗粒汤剂与传统汤剂的指纹图谱，结合化学计量学方法评价中药配方颗粒汤剂与传统汤剂质量一致性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Heraeus Pico17微量高速离心机（美国赛默飞公司）；Elix Essential纯水/Simplicity Ultrapure超纯水系统（美国密理博公司）；BT25S分析天平（德国赛多利斯公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海雅荣公司）；MO-2型电热套（黄骅新兴电器厂）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版，国家药典委员会）。

1.2 试剂与试药 乙腈（HPLC级，天津市康科德公司）、甲酸（HPLC级，Merck公司）、流动相用水为纯水/超纯水系统制备。甘草苷对照品（批号111610-201908，含量以95.0%计）、黄芩苷对照品（批号110715-201821，含量以95.4%计）、鸟苷对照品（批号111977-201501，含量以93.6%计）、盐酸小檗碱对照品（批号110713-201814，含量以86.7%计）均购自中国食品药品检定研究院，甘草酸铵对照品（批号1001167400）购自Sigma-Aldrich公司。炙甘草、清半夏、黄芩、黄连、干姜、大枣饮片与配方颗粒（相关药材、配方颗粒批次及换算得率见表1）均由江阴天江药业公司提供，饮片经天津中医药大学李天祥教授鉴定，均符合2020版《中国药典》第一部项下有关规定。

表1 饮片、配方颗粒信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agela venusil MP C18（2）（250 mm×4.6 mm，5μm，序列号：029080）；流动相：A相为0.2%甲酸-水，B相为乙腈，流速1.0 ml/min，梯度洗脱程序为：0~6 min，4.0%B；6~9 min，4.0%→7.0%B；9~20 min，7.0%→15.0%B；20~25 min，15.0%→17.5%B；25~35 min，17.5%→19.0%B；35~50 min，19.0%→25.0%B；50~65 min，25.0%→27.5%B；65~80 min，27.5%→35.0%B；80~95 min，35.0%→50.0%B；95~100 min，50.0%→90.0%B；100~110 min，90.0%B；双检测波长为265 nm、327 nm，柱温为25℃，进样量：10μl，采集时间：110 min。

2.2 汤剂的制备 每味药材饮片按照组方配比（炙甘草12 g，黄芩9 g，干姜9 g，半夏12 g，大枣36 g，黄连3 g）称取10份全方（从现有的3个批次中取组合成10份，组合见表2）及对应重量各单味药，10份全方传统汤剂组方T1～T10，约81 g。加约9倍量水，浸泡30 min，回流提取30 min，以200目滤网滤过；再加约7倍量水，回流提取20 min，200目滤网滤过，合并滤液，减压浓缩（温度不超过50度）后转移至量瓶定容成约0.2 g生药/ml的混悬液，冷藏备用。各单味药加水量及定容浓度按全方重量计算，并按上述方法制备。

表2 10份汤剂饮片批次组合表

根据各单味药配方颗粒得率换算等同组方比例的生药量，按表2组合每组称取2份全方配方颗粒，1份按0.2 g生药/ml的浓度计算加水量，加开水混悬摇匀后加热回流5 min，放冷后转移至量瓶定容，冷藏备用，记为配方颗粒煎煮汤剂dec.FD1～dec.FD10；另1份加等量开水混悬摇匀放冷后转移至量瓶定容，冷藏备用，记为配方颗粒热溶汤剂dis.FD1～dis.FD10。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液制备 依次精密吸取上述T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10、6个单味药传统汤剂样品各1 ml，置于EP管中，加入1 ml甲醇，涡旋振荡1 min，12 000 r/min离心5 min，吸取上清液，即得传统汤剂供试品溶液T1～T10、各单味药供试品溶液、配方颗粒煎煮汤剂供试品溶液dec.FD1～dec.FD10和配方颗粒热溶汤剂供试品溶液dis.FD1～dis.FD10。

2.3.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取甘草苷、甘草酸铵、黄芩苷、盐酸小檗碱、鸟苷对照品适量，加50%甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度分别为0.221 6、0.214 0、0.215 6、0.202 4和0.215 2 mg/ml的对照品溶液，分别精密吸取甘草苷、甘草酸铵、黄芩苷、盐酸小檗碱、鸟苷对照品溶液母液5.0、1.0、1.0、1.0和2.0 ml至10 ml量瓶中，混匀，制成混合对照品溶液。

2.4 精密度试验 取T1号传统汤剂1份，按供试品溶液处理方法制备T1号供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6针，导出数据采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行匹配处理。根据匹配结果，265 nm色谱图各共有峰tR（保留时间）的RSD值均小于0.37%，A（峰面积）的RSD值均小于2.83%，以39号共有峰为参照峰，各共有峰Ar（相对峰面积）的RSD值均小于3.21%；327 nm色谱图各共有峰tR的RSD值均小于0.14%，A的RSD值均小于2.85%，以25号共有峰为参照峰，各共有峰的Ar的RSD值均小于3.29%，表明该方法精密度良好。

2.5 重复性试验 制备6份T1号传统汤剂，按供试品溶液处理方法得6份T1号供试品溶液，按“2.1”项色谱条件依次进样，导出数据采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行匹配处理。根据匹配结果，265 nm色谱图各共有峰的tR的RSD值均低于0.38%，A的RSD值均小于2.88%，以39号共有峰为参照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于4.08%；327 nm色谱图各共有峰tR的RSD值均低于0.33%，A的RSD值均小于2.89%，以25号共有峰为参照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于3.95%，表明方法具有较好的重复性。

2.6 稳定性试验 取T1号传统汤剂的供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别在0、2、4、8、12和24 h进样，导出数据采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行匹配处理。根据匹配结果，265 nm色谱图各共有峰tR的RSD值均小于0.64%，A的RSD值均小于2.84%，以39号共有峰为参照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于3.85%；327 nm色谱图各共有峰tR的RSD值均小于0.18%，A的RSD值均小于2.68%，以25号共有峰为参照峰，各共有峰Ar的RSD值均小于3.63%，表明样品放置24 h较稳定。

2.7 甘草泻心汤样品测定及指纹图谱的建立

2.7.1 样品测定 精密吸取T1～T10、各单味药、各单味药阴性对照、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10和混合对照品溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。

2.7.2 传统汤剂指纹图谱的建立 导出265 nm和327 nm色谱文件，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统对10批传统汤剂样品数据进行分析，以S1样品（T1）图谱作为参照谱，设置中位数法，时间窗0.2 min，多点校正后进行全谱峰匹配，生成对照指纹图谱（R），匹配共有峰，计算非共有峰占比、相似度。选取两个波长共有峰的并集作为综合共有峰，选取T2样品溶液、混合对照品溶液和各单味药样品溶液进行液质联用测定（该试验及数据将在“基于HPLC-QTOF/MS技术的甘草泻心汤化学成分分析”一文中同时发表，本文引用），以标定综合共有峰的化合物归属。根据中药指纹图谱相似度评价系统分析，265 nm指纹图谱匹配出50个共有峰，T1~T10非共有峰占比分别为3.03%、6.57%、2.51%、2.21%、2.01%、1.72%、2.56%、2.19%、3.04%、3.05%，10批样品间相似度不低于0.992。327 nm指纹图谱匹配出31个共有峰，T1~T10非共有峰占比分别为10.56%、13.16%、10.67%、7.90%、10.06%、8.25%、10.08%、9.06%、8.45%、7.94%，10批样品间相似度不低于0.994。10批传统汤剂265 nm和327 nm色谱指纹图谱见图1。

图1 10批传统汤剂265 nm（A）和327nm（B）色谱指纹图谱

2.7.3 传统汤剂指纹图谱综合共有峰的标定 对两个波长色谱图分别按Mark峰匹配方法生成对照指纹图谱，再将两个对照指纹图谱导入相似度评价软件进行全谱峰匹配生成对照指纹图谱，包含54个色谱峰（两个波长共有峰的并集，见图2），本文将其定义为综合共有峰，将各综合共有峰分别以43号色谱峰（对应于265 nm的39号和327 nm的25号共有峰）为参照峰，计算各综合共有峰的tRr（相对保留时间）。前期试验［16］已对甘草泻心汤样品溶液进行化合物鉴定分析，根据液质联用测定各离子峰的tRr与指纹图谱各综合共有峰tRr比较来标定综合共有峰的化合物名称及单味药来源（见表3）。

表3 综合共有峰化合物归属和药材归属情况

图2 甘草泻心汤传统汤剂指纹图谱对照指纹图谱综合共有峰情况

2.7.4 传统汤剂与配方颗粒汤剂指纹图谱的比较对10批配方颗粒煎煮汤剂、10批配方颗粒热溶汤剂进行组内相似度分析，并比较配方颗粒汤剂综合共有峰匹配情况。以传统汤剂共有模式分别作为煎煮汤剂和热溶汤剂的对照图谱，分析各自与传统汤剂共有模式的相似度。10批配方颗粒煎煮汤剂样品两个波长指纹图谱相似度均在0.999以上，内部相似度良好，与传统汤剂综合共有峰比较，煎煮汤剂共有峰中未匹配到4、6、16、22、26号综合共有峰。10批配方颗粒热溶汤剂样品两个波长指纹图谱相似度均在0.998以上，内部相似度良好，与传统汤剂综合共有峰比较，热溶汤剂共有峰中未匹配到4、6、9、22、26、30、31、32、39、40、51、52号综合共有峰。dec.FD1～dec.FD10与传统汤剂共有模式的相似度两个波长下均在0.996以上，dis.FD1～dis.FD10与传统汤剂共有模式的相似度两个波长下均在0.995以上；说明配方颗粒煎煮汤剂、配方颗粒热溶汤剂与传统汤剂之间相似度良好。

2.8 化学计量学分析

2.8.1 层次聚类分析 将T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10三组匹配结果剔除综合共有峰以外的色谱峰，且选取吸光度大的波长的色谱峰面积数据作为综合共有峰峰面积，导入联川生物云平台的热图云工具采用欧式距离进行层次聚类分析。层次聚类分析数据矩阵中，每一行代表一个特征峰，每一列代表一个样品，深色代表表达量较高，浅色代表表达量较低。图中大致被分成三部分：10、47、53、11、36、34、35号峰为第一部分；17、12、19、20、1、25、9、5、15、46、14、24、4、6、22、21、23、27、29、26、44、16、28、41、42、37、45号峰为第二部分；18、48、50、38、49、33、40、30、39、31、32、7、8、51、52、2、13、43、3、54号 峰 为 第三部分。通过观察第一部分和第二部分共有峰的表达，可以明显地区分传统汤剂与配方颗粒汤剂，而配方颗粒煎煮汤剂和热溶汤剂共有峰表达差异不大，见图3。

图3 甘草泻心汤三种汤剂层次聚类分析

续表3 综合共有峰化合物归属和药材归属情况

2.8.2 主成分分析 本文通过对T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10指纹图谱综合共有峰峰面积进行无监督的PCA分析。无监督PCA分析显示（见图4），第一主成分（PC1）的累积贡献率为53.6%，第二主成分（PC2）的累积贡献率为15.3%，第三主成分（PC3）的累积贡献率为7.52%，其他累积贡献率忽略不计，PCA累计贡献率R2X=0.764，贡献度较高；PCA模式识别，Q2=0.531，预测能力一般。传统汤剂与配方颗粒汤剂被划分在不同的区域范围，区分效果明显。配方颗粒汤剂样本聚落得较为集中，传统汤剂样本聚落得较为分散。

图4 甘草泻心汤3种汤剂主成分分析

2.8.3 偏最小二乘法判别分析 通过对T1～T10、dec.FD1～dec.FD10、dis.FD1～dis.FD10指纹图谱综合共有峰峰面积进行PLS-DA分析。PLS-DA分析显示（见图5），模式识别的建模参数优于PCA，R2Y=0.779，Q2=0.66，模型对组间变量的解释度较好，预测能力一般，得分图中三组间分离趋势明显，特别是颗粒剂两组样品既相对集中又体现出提取方式不同的差异，与传统汤剂相比，说明颗粒剂与传统汤剂存在差异，但是根据模型解释度与预测性数据判断，差异显著性不大。三组之间差异综合共有峰得分图见图6，提取VIP>1的潜在差异综合共有峰分别为47、49、16、26、9、38、32、11、7、22、8、36、53、24、42、6、14、27、4、46和17号峰。

图5 甘草泻心汤3种汤剂PLS-DA分析

图6 甘草泻心汤3种汤剂差异综合共有峰得分图

3 讨论

近年来，中药配方颗粒运用得到了较快发展，一些问题也随之出现，其与传统汤剂的一致性也成了大家关心的一个重要问题。中药作为一个复杂的化学体系，在考查配方颗粒与传统汤剂一致性时很难像化学药一样以某个化学实体作为评价标准，指纹图谱可以有效地表征中药复杂体系所含化学成分的种类和数量。当前中药指纹图谱研究方法有薄层色谱法、气相色谱法、高效毛细管电泳、高效液相色谱法等色谱方法，以及紫外光谱法、（近）红外光谱法等光谱方法。其中HPLC因其良好的分离性能、较高的检测灵敏度，且在医药研发、生产、监管单位具有较高的普及率而使得中药HPLC指纹图谱成为指纹图谱的主流。本文以甘草泻心汤为研究对象，建立了两个波长下传统汤剂和配方颗粒汤剂（热溶、煎煮）HPLC指纹图谱，分析方法精密、稳定，可重复。10批传统汤剂指纹图谱相似度较高，配方颗粒（热溶、煎煮）汤剂指纹图谱组内相似度及与传统汤剂指纹图谱之间相似度均较高。根据层次聚类分析、主成分分析和偏最小二乘判别分析等化学计量学分析，传统汤剂与配方颗粒汤剂之间可以明显的区分开，而配方颗粒煎煮汤剂和热溶汤剂共有峰表达差异不大，这也表明配方颗粒直接用热水溶解即可，无需再进行煎煮；配方颗粒（热溶、煎煮）汤剂样本聚落得较为集中，传统汤剂样本聚落得较为分散，说明配方颗粒具有良好均一性。

本文通过比对了多个波长的指纹图谱，确定了265 nm和327 nm两个波长，其中265 nm出峰较多，但有一些色谱峰265 nm波长下没有或者非常低，而在327 nm波长峰较高，故采用了两个波长的指纹图谱。同时为了便于比较，本文提出了综合共有峰的概念，即两个波长共有峰的并集，取峰面积大的波长的数据作为进一步多元统计分析的数据。

本文出于考查配方颗粒生产过程及调配成汤剂过程中加热煎煮、热水溶解等环节对药材成分的影响，选用与配方颗粒对应的同批次药材制成传统汤剂进行比较，基于本文的结果及研究方法，后期将进一步扩大药材产地批次建立更具有代表性的传统汤剂对照指纹图谱，并对更大范围厂家的配方颗粒商品进行一致性评价。