HPLC测定薏苡仁中玉米赤霉烯酮的不确定度评定

莫毛燕，程 敏，张龙开，林伟斌，谭丽容

(弘正道(中国)中药研究有限公司，广东 广州 510665)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，又称F-2雌性发情毒素，是由玉米赤霉菌、禾谷镰刀菌、三线镰刀菌等真菌产生的有毒代谢产物，广泛存在于谷类作物，具有较强的生殖毒性和致畸作用，会对人体产生较大的危害[1-2]。薏苡仁是药食两用的常用中药，使用范围广、用量大，但薏苡仁容易被真菌毒素污染，其检出玉米赤霉烯酮的频率非常高[3]。在2020版《中国药典》中，明确规定了薏苡仁玉米赤霉烯酮的限量要求。因此，准确测定薏苡仁中玉米赤霉烯酮的含量具有重要意义。

然而在实际检测工作中，测量结果与实际值往往存在一定的偏离，所以测量结果的不确定度评定显得尤为重要。本文根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[4]和CNAS-GL06：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[5]规定的基本方法和程序，系统全面地对高效液相色谱法测定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量的测量不确定度进行评定，以期为玉米赤霉烯酮检测数据使用和准确评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(DIONEX Ultimate 3000，配荧光检测器)，美国Thermo Fisher公司；MS204TS型电子天平(d=0.1 mg)，瑞士Mettler公司；FJ-200J型高速分散均质机，上海沪析实业有限公司；ST16R型离心机，美国Thermo Fisher公司；玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，上海安谱实验科技股份有限公司；Visiprep DL型固相萃取装置，Supelco公司。

玉米赤霉烯酮对照品溶液(标示浓度49.9 μg/mL)，美国o2si公司；甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，德国Merck公司；氯化钠(分析纯)，广州化学试剂厂；所有用水均为超纯水；市售薏苡仁药材。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液的配制

精密量取玉米赤霉烯酮标准溶液1 mL，加甲醇制成每 1 mL含5 μg的溶液，作为标准贮备溶液。精密量取标准贮备溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得标准使用液。

1.2.2 供试品溶液的制备

取薏苡仁粉末约20 g(过二号筛)，精密称定，置于匀质瓶中，加入氯化钠4 g，精密加入90%乙腈溶液100 mL，高速搅拌2 min(搅拌速度大于11000 r/min)，离心10 min(离心速度4000 r/min)，精密量取上清液10 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，离心10 min(离心速度4000 r/min)，量取上清液20.0 mL，通过免疫亲和柱，流速每分钟3 mL，用水10 mL洗脱，弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，取续滤液，即得。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C18，4.6×250 mm，5 μm；柱温：30 ℃；流动相:乙腈:水=50:50(V/V)，流速：1.0 mL/min；检测器：荧光检测器；激发波长：232 nm，发射波长：460 nm。

1.2.4 测定法

分别精密吸取“1.2.1”项下对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取供试品溶液30 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于玉米赤霉烯酮的量，计算，即得。

2 结果与分析

2.1 数学模型的建立

不确定度的计算，首先明确被测值计算的数学模型，从而分析其可能的不确定度来源。高效液相色谱法测定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量计算数学模型为：

式中，X为薏苡仁试样中玉米赤霉烯酮的含量，μg/kg；C为由标准曲线计算得到玉米赤霉烯酮的质量，ng；V1为试样稀释总体积，mL；V2为供试品溶液进样体积，μL；m为试样质量，g；1000为单位换算系数；rep为测量重复性；Rec为回收率。

2.2 不确定度的来源分析

根据数学模型及测量过程分析，高效液相色谱法测定薏苡仁中玉米赤霉烯酮的测量不确定度有以下几个来源：测量重复性引入的不确定度；标准溶液配制引入的不确定度；标准曲线拟合引入的不确定度；样品称量过程引入的不确定度；样品溶液体积引入的不确定度；进样体积引入的不确定度；回收率引入的不确定度。

2.3 测量不确定度评定

2.3.1 测量重复性引入的不确定度urel(rep)

测量重复性引入的标准不确定度：

=0.372 μg/kg

测量重复性引入的相对标准不确定度：

2.3.2 标准溶液配制引入的不确定度urel(CS)

标准溶液配制引入的不确定度u(CS)，包括标准物质溶液引入的不确定度u1(CS)、标准贮备液配制引入的不确定度u2(CS)、标准使用液配制引入的不确定度u3(CS)。

2.3.2.1 标准物质溶液引入的不确定度u1rel(Cs)

玉米赤霉烯酮标准物质证书给出的标准值为49.9 μg/mL，扩展不确定度为U=0.64 μg/mL(k=2)，则玉米赤霉烯酮标准物质引入的相对标准不确定度为：

2.3.2.2 标准贮备液配制带来的不确定度u2rel(Cs)

2.3.2.3 标准使用液配制带来的不确定度u3rel(Cs)

2.3.2.4 标准溶液配制过程的合成不确定度urel(CS)

标准溶液配制引入的相对标准不确定度合成为：

2.3.3 标准曲线拟合引入的不确定度urel(S)

取“2.3.1”项下标准使用液按法注入液相色谱仪测定，每个进样量水平测定2次，测得的峰面积如表1所示。

表1 标准曲线测量结果

标准曲线采用最小二乘法进行线性拟合，所得回归方程为A=16792.6157C+210.1207，相关系数R2=0.9999，其中A为玉米赤霉烯酮的峰面积，C为玉米赤霉烯酮进样量。样品重复测定6次，峰面积代入线性回归方程计算得到样品中玉米赤霉烯酮的质量分别为0.659、0.682、0.668、0.681、0.665、0.686 ng，平均值C样=0.674 ng，标准曲线拟合引入的标准不确定度按以下公式计算：

式中：SA—标准曲线峰面积A的残余标准差

b—标准曲线的斜率，b=16792.6157

p—样品的重复测定次数，p=6

n—标准溶液测定总次数，n=10

C样—样品用该曲线进行测定6次，测得玉米赤霉烯酮的平均质量，C样=0.674 ng

Ci—标准曲线各点进样量，ng

Ai—标准曲线各点峰面积的测定值

a—标准曲线的截距，a=210.1207

因此，由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为：

2.3.4 样品称量过程引入的不确定度urel(m)

实验过程使用万分之一电子天平称取20.0000 g样品，查天平检定证书，其扩展不确定度为U=0.2 mg，k=2，则称量过程引入的标准不确定度为：

2.3.5 样品溶液体积引入的不确定度urel(V1)

2.3.5.1 玻璃量器校准引入的不确定度u1rel(V1)

本实验前处理过程中使用到100 mL单标吸量管1次，10 mL单标吸量管1次，20 mL单标吸量管1次，50 mL容量瓶1次，2 mL容量瓶1次，所用的玻璃量器均为A级，查检定证书，确定其扩展不确定度U。玻璃量器引入的相对标准不确定度如表2所示。

表2 样品前处理过程使用的玻璃量器体积校准引入的不确定度

将表2中各不确定分量进行合成，得到玻璃量器校准引入的相对标准不确定度：

2.3.5.2 体积因温度变化引入的不确定度u2rel(V1)

表3 温度波动引入的不确定度

将表3中各不确定分量进行合成，得到体积因温度变化引入的相对标准不确定度：

2.3.5.3 样品溶液体积的合成不确定度urel(V1)

样品溶液体积引入的相对标准不确定度合成为：

2.3.6 进样体积引入的不确定度urel(V2)

进样体积引入的不确定度属于高效液相色谱仪的不确定度分量，在测量重复性不确定度分量中已进行了评定，在此不再重复评定。

2.3.7 回收率引入的不确定度urel(Rec)

表4 回收率引入的相对标准不确定度(n=9)

2.4 计算扩展不确定度并报告结果

将各不确定度分量进行合成：

=0.0170

薏苡仁样品中玉米赤霉烯酮含量为56.081 μg/kg，则合成标准不确定度为：

取包含因子k=2，置信概率95%，测量结果的扩展不确定度为：

U=k×u(X)=2×0.953=1.91 μg/kg

因此，高效液相色谱法测定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量测定结果可表示为：X=(56.08±1.91)μg/kg，k=2，置信概率95%。

3 结 论

本文对高效液相色谱法测定薏苡仁中玉米赤霉烯酮含量的不确定度进行了量化分析。结果表明，影响玉米赤霉烯酮检测结果准确性的重要不确定度分量为回收率，次要不确定度分量分别为标准溶液配制和标准曲线拟合。因此，在日常检验过程中，应通过规范检测人员的操作、优化样品前处理方法、调整仪器的性能、选用精度高并计量合格的玻璃量器、加强实验环境温度的控制等方式，来减小测量结果的不确定度，从而提高检测结果的准确性。