三倍体漆树组织培养无菌体系建立技术研究

王壮卢宇马东晓

（1西南林业大学云南生物多样性研究院，云南昆明 650224；2西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南昆明 650224）

漆树（Toxicodendron vernicifluum）是漆树科（Anacardiaceae）漆属（Toxicidendron）的一种落叶乔木，有“涂料之王”的美誉[1]，被广泛用于军工、冶炼、石油、化工、采矿、纺织印染、工艺品加工及家具表面处理等领域[2]。漆树的主要产品是生漆，化学油漆的出现曾导致生漆市场在较长时期处于低迷状态。近年来，随着人们环保意识的增强和对绿色家居生活方式的追求，生漆作为环保油漆的重要原料，越来越受到人们的关注，发展前景非常广阔[3]。三倍体漆树（2n=3x=45）在自然界存在数量极少，是具有较高实用价值的经济树种，生长迅速，高产优质生漆，同时具有抗寒冷、抗干旱、抗病虫害等特点[4]，深受漆农欢迎。本文选用当年生三倍体漆树幼嫩茎段为外植体，对其进行消毒时间、方法与腋芽诱导研究，以期为三倍体漆树无性繁殖推广与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取西南林业大学格林温室大棚内无病虫害、生长健壮的当年生三倍体漆树幼嫩茎段为外植体，于晴天上午 8：00—9：00采集。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体预处理。选取生长健壮的三倍体漆树幼嫩茎段，用剪刀剪去多余枝条和叶柄，先用纱布蘸取0.2%次氯酸钠溶液清洗茎段2～3 min，其间不断擦拭茎段表面，用自来水冲洗3～5次后，将材料上的残留水珠用纱布擦拭干净。

1.2.2 外植体消毒。分别使用75%乙醇和0.1%升汞进行茎段表面消毒处理。采用75%乙醇浸泡振荡30、60、90 s与 0.1%升汞浸泡振荡 2、4、6 min 的处理组合进行消毒时间试验，共计9个处理。每个处理接种10瓶，每瓶接种2个茎段，3次重复。接种3 d后观察是否有污染产生，7 d后统计其污染率，根据各组污染情况确定最适宜的消毒时间处理组合。

1.2.3 腋芽诱导培养。光照强度为2 000～2 500 lx，培养室温度为（23±2）℃，光照周期为 12 h/d。

（1）基本培养基筛选。基本培养基选用MS、1/2 MS、DCR、WPM、White，上述基本培养基中均添加蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L，pH值为5.8～6.2。每种基本培养基为一个处理，每个处理接种10瓶，每瓶接种2个茎段。接种时，将茎段垂直插入基本培养基上进行培养。30 d后统计诱导率及腋芽的生长情况，最终筛选出适宜三倍体漆树腋芽诱导的基本培养基。

（2）外源激素筛选。以选出的培养基为三倍体漆树腋芽诱导基本培养基，设计不同配比的外源激素组合，共计12个处理，不同外源激素组合方案如表1所示。将三倍体漆树外植体分别接种于培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种2个茎段，30 d后统计平均诱导腋芽数、平均苗高及幼苗的生长情况。

表1 三倍体漆树腋芽诱导外源激素筛选设计

（3）活性炭添加量筛选。以筛选出的基本培养基和外源激素（MS+6-BA 0.3 mg/L+ZT 0.2 mg/L）为基础，设计不同量活性炭配比，共计5个处理，活性炭添加量分别为 0、0.1、0.2、0.3、0.4 g/L。 选取适宜三倍体漆树外植体接种于该培养基中，每个处理接种10瓶，每瓶接种2个茎段，30 d后统计平均诱导腋芽数、平均苗高及幼苗生长情况，最终筛选出适宜三倍体漆树腋芽诱导培养的较优培养条件。不同活性炭添加量配比组合方案如表2所示。

表2 三倍体漆树腋芽诱导活性炭添加量筛选设计

2 结果与分析

2.1 不同处理对三倍体漆树外植体消毒效果的影响

从表3可以看出，75%乙醇消毒30 s，0.1%升汞分别消毒2、4、6 min处理的外植体污染率均较高，分别为80.00%、86.70%、73.30%。说明以上处理均不能有效抑制外植体污染的发生。但75%乙醇消毒30 s、0.1%升汞消毒6 min处理的外植体生长情况较好，其余2个处理外植体的生长情况均不理想。在9个处理组合中，75%乙醇消毒30 s、0.1%升汞消毒4 min处理的污染率最高，为86.70%；75%乙醇消毒90 s，0.1%升汞消毒4、6 min，外植体的污染率均为0，但生长情况较差，成活率较低，分别为40.0%、33.3%；75%乙醇消毒60 s、0.1%升汞消毒4 min处理的外植体污染率较低，为13.30%，成活率达95.0%，生长情况也为良好。综上所述，9个处理组合中，75%乙醇消毒60 s、0.1%升汞消毒4 min处理为三倍体漆树外植体最佳消毒处理组合。

表3 不同处理下消毒效果比较

2.2 腋芽诱导培养

2.2.1 基本培养基对三倍体漆树腋芽诱导效果的影响。不同的基本培养基对三倍体漆树外植体的腋芽诱导效果不同。由表4可知，在5个处理中，以MS、1/2 MS、WPM、White为基本培养基处理的萌芽率均较理想，以MS、1/2 MS为基本培养基处理的出芽质量均能达到良好，但以MS为基本培养基处理的生长状态更好，叶片翠绿，腋芽粗壮。以White培养基诱导出的主芽质量一般。以DCR为基本培养基的萌芽率很低，仅为30%，无腋芽，茎段呈红色。说明在三倍体漆树腋芽诱导阶段，以DCR为基本培养基难以成功诱导出芽。综上所述，以MS、1/2 MS为基本培养基处理的腋芽诱导效果均良好，以MS、1/2 MS、WPM为基本培养基处理萌芽率均达到95%，以MS基本培养基处理的出芽质量更好。因此，MS培养基为三倍体漆树腋芽诱导最佳基本培养基。

表4 不同基本培养基腋芽诱导效果

2.2.2 不同外源激素对三倍体漆树腋芽诱导效果的影响。以MS基本培养基为基础，将外植体置于不同激素处理下，三倍体漆树外植体的腋芽诱导效果不同。由表5可知，处理A1、A6、A8的萌芽率均为95%，但处理A6与处理A8的出芽质量均不理想。说明处理A1的激素种类和添加量较适合三倍体漆树腋芽的诱导。处理A7、A12均未添加细胞分裂素，其中处理A7添加NAA，处理A12添加IBA，处理A7的萌芽率仅为50%，处理A12的萌芽率为0。说明在三倍体漆树腋芽诱导阶段，仅添加生长素NAA或仅添加生长素IBA不适宜腋芽诱导培养。处理A1、A2中均添加了细胞分裂素（6-BA、ZT），处理 A2在添加 6-BA、ZT的基础上添加了生长素NAA，处理A2的萌芽率较处理A1低。说明在三倍体漆树腋芽诱导阶段，向培养基中加入生长素NAA不利于腋芽诱导。

表5 不同外源激素处理下腋芽诱导效果

2.2.3 活性炭添加量对三倍体漆树腋芽诱导效果的影响。由表6可知，在75%乙醇消毒60 s、0.1%升汞消毒4 min条件下，各处理萌芽率均能达90%以上，其中处理B1和处理B4萌芽率均为95%，处理B2、B3、B5萌芽率均为90%。从出芽质量来看，未添加活性炭的处理B1与添加0.1 g/L活性炭的处理B2茎段略黑，处理B3部分茎段略黑，处理B4茎段颜色为翠绿且腋芽生长健壮（图1）。说明在三倍体漆树腋芽诱导阶段，添加活性炭0.3 g/L以上能够有效抑制三倍体漆树幼嫩茎段褐化。综上所述，结合萌芽率和出芽质量，处理B4萌芽率最高（95%）、茎段翠绿、腋芽健壮。因此，最适宜三倍体漆树腋芽诱导的培养基为MS+6-BA 0.3 mg/L+ZT 0.2 mg/L+活性炭0.3 g/L。

表6 不同活性炭添加量处理下腋芽诱导效果

3 结论与讨论

以当年生三倍体漆树幼嫩茎段为外植体，主要选取其包含顶芽的上三节幼嫩茎段进行腋芽诱导，腋芽诱导时间短，污染率较低。该幼嫩茎段是理想的三倍体漆树外植体。组织培养体系建立的前提是建立无菌体系，因而保证外植体低污染率对建立组培体系十分重要[5]。杨 宏等[6]采用9种培养基进行长山核桃茎段腋芽萌发诱导，结果表明，这9种处理几乎均可诱导腋芽萌发，最佳的诱导组合是WPM+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.01 mg/L。罗一然等[7]研究发现，适宜小木漆幼嫩茎段的消毒方法为75%乙醇浸泡20 s、0.05%苯扎氯胺浸泡1 min、0.1%升汞浸泡20 min；6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L组合的腋芽萌发率最高，达到91.67%，但与6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L组合的萌发率（88.33%）差异不显著，这表明细胞分裂素6-BA在诱导外植体腋芽萌发时具有明显的促进作用。李锦宇等[8]研究表明，综合考虑外植体的污染率与存活率，适宜日本野漆树外植体的消毒方法为75%乙醇浸泡10 s+2.0%洁尔灭浸泡1.5 min+0.1%升汞浸泡4 min。从基本培养基来看，MS培养基上萌发的腋芽粗壮，White培养基上萌发的腋芽直径处于中等，而1/2 MS培养基上萌发的腋芽细瘦。李 斌等[9]研究发现，75%乙醇浸泡15 s、0.1%升汞浸泡10 min为金铁锁外植体消毒的最理想条件。本文通过设计不同的消毒组合后得出：先用纱布蘸取0.2%次氯酸钠溶液清洗三倍体漆树茎段2～3 min，其间不断擦拭其表面，再用自来水冲洗3～5次，将材料上的残留水珠用纱布擦拭干净后用75%酒精浸泡60 s、0.1%升汞浸泡4 min进行外植体消毒，能够有效地对三倍体漆树茎段进行表面消毒，能最低限度地损害腋芽，腋芽诱导后的污染率也较低。在三倍体漆树腋芽诱导阶段，最佳腋芽诱导培养基组合为MS+6-BA 0.3 mg/L+ZT 0.2 mg/L+活性炭0.3 g/L。