乌药成分异乌药内酯抗H.pylori及其抗菌谱的筛选

覃春，徐佳音，王雪，管爱星，廖丽娟，黄永毅，黄赞松

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心，广西 百色 533000)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一种可定植于人胃黏膜上皮细胞的革兰阴性、微需氧螺旋杆菌，是导致胃部疾病轻、中、重疾病的主要原因[1]。世界超过50%的人口胃内定植有H.pylori，美国将H.pylori明确归为致癌物。治疗并根除H.pylori已成为治疗消化性溃疡及预防胃癌发生的重要手段。由于抗生素的广泛使用引起的细菌耐药，导致H.pylori的根除率逐年下降，耐药率随之上升，发掘新的抗H.pylori药物非常必要[2]。随着中药的不断发掘，其抗菌作用也逐渐被发现。乌药[Linderaaggregata(Sims)Kosterm]属樟科植物，其干燥后的块根是常用的行气止痛药物，可治疗胸腹胀痛、产后腹痛、寒气郁滞、痛经、头痛、尿频、遗尿等症状。乌药中主要含有挥发油、异喹啉生物碱、呋喃倍半萜及其内酯、黄酮类等成分。异乌药内酯，又名异乌药醚内酯，属于乌药主要成分中呋喃倍半萜内酯化合物的一种[3]。研究显示，异乌药内酯在卵巢癌、乳腺癌及肺癌等多种肿瘤中具有抑制其增殖、转移或促进凋亡的作用[4-7]。近几年，其抗炎作用逐渐被发现，在酒精性肝损伤或小鼠炎症模型中均发现其抗炎作用[8-10]。另有研究表明异乌药内酯在肝脏糖代谢中也起到关键作用[11]。但异乌药内酯在抗菌方面鲜有研究，特别是对H.pylori的抗菌作用很少见报道。因此，本研究针对异乌药内酯对H.pylori及非H.pylori菌株的抑制作用展开研究，筛选其抗菌谱，以期探究其抗菌作用，并为后期研发先导药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 异乌药内酯(CAS号：957-66-4)购于成都瑞芬思生物科技有限公司，BactoTM Brain Heart infusion(BHI)培养基、哥伦Columbia blood Agar base(G)培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、标准小牛血清均购于南京晶格化学科技有限公司，H.pylori标准菌株(26695、NSH57、MSD132、G27)由南京医科大学毕洪凯实验室赠送，H.pylori临床分离菌株(HPBS001-HPBS016)为本实验室分离获得。非Hp菌株：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、新生隐球菌、奇异变形杆菌、热带假丝酵母、空肠弯曲菌、枯草芽孢杆菌、摩氏摩根菌、溶血葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、醋杆菌、大肠杆菌、弯曲乳杆菌、酿酒酵母、脆弱拟杆菌、长双歧杆菌、霍氏肠杆菌均购自广东微生物保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 质谱分析 化合物异乌药内酯质谱分析由成都瑞芬思公司完成。

1.2.2 细菌培养 使用含10%小牛血清的哥伦比亚固体培养基或脑心浸液培养基，于37 ℃、5%O2、10% CO2培养箱或摇床中进行培养。

1.2.3 微量稀释法检测异乌药内酯对H.pylori菌株最小抑菌浓度(MIC) ①药物制备：配置异乌药内酯浓度为4 mg/ml。②菌液准备：将对数期H.pylori菌液调整浓度OD600为0.3(1.0×108CFU/ml)，稀释至1.0×107CFU/ml，备用。③96孔板制备：以96孔板A1～A12孔作为药物浓度最高孔，加入173.6 μl培养基及6.4 μl上述药物，余下7孔均加入90 μl培养基，从上至下对倍稀释至第8孔，使药物浓度从1～8孔浓度分别为128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml。设置培养基空白对照孔、药物阴性孔、细菌阳性孔。④接种菌液：取上述备用菌液10 μl加至第1～8孔和阳性孔中(工作浓度为1×106CFU/ml)，阴性孔不加菌对照。⑤结果判读：以培养基空白对照孔、药物阴性孔无菌生长、细菌阳性孔有菌生长为前提进行结果判读，以完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为MIC。如果出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如果出现多处跳孔，则该次结果作废。实验重复3次。

1.2.4 微量稀释法检测异乌药内酯对非H.pylori菌株MIC ①药物制备：配置异乌药内酯浓度为4 mg/ml。②菌液准备：将对数期菌液调整浓度细菌OD600为0.3(1×108CFU/ml)，稀释至1×106CFU/ml，真菌调整浓度OD600为0.5(5×106CFU/ml)，稀释至5×103CFU/ml，备用。③96孔板制备：以96孔板A1～A12孔作为药物浓度最高孔，加入173.6 μl培养基及6.4 μl上述药物，余下7孔均加入90 μl培养基，从上至下对倍稀释至第8孔，使药物浓度从1～8孔浓度分别为128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml。设置培养基空白对照孔、药物阴性孔、细菌阳性孔。④接种菌液：取上述备用菌液10 μl加至第1～8孔和阳性孔中(细菌工作浓度为1×105CFU/ml，真菌工作浓度为5×102CFU/ml)，阴性孔不加菌对照。⑤结果判读：以培养基空白对照孔、药物阴性孔无菌生长、细菌阳性孔有菌生长为前提进行结果判读，以完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为MIC。如果出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如果出现多处跳孔，则该次结果作废。实验重复3次。

2 结果

2.1 异乌药内酯的分子结构式及质谱图 异乌药内酯分子式为C15H16O3，分子结构，如图1A；异乌药内酯分子量为 244.29，质谱为图1B，鉴定图谱由成都瑞芬思生物科技有限公司完成。

2.2 异乌药内酯对H.pylori菌株的抑制作用 对18种不同H.pylori菌株进行MIC检测，如表1所示，异乌药内酯对敏感、耐药、甚至多重耐药H.pylori菌株MIC均在8～16 μg/ml，表明异乌药内酯对H.pylori具有良好的抑制作用，且对不同H.pylori菌株间抑制作用强度相似，菌株耐药性对其抑制作用无明显影响。

A.异乌药内酯的分子结构式；B.异乌药内酯的质谱图

表1 异乌药内酯对不同H.pylori菌株的抑制作用

2.3 异乌药内酯对非H.pylori菌株的抑制作用 为筛选异乌药内酯的抗菌谱，选择金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、白色念珠菌、新生隐球菌、奇异变形杆菌、热带假丝酵母、空肠弯曲菌、枯草芽孢杆菌等20种细菌及真菌进行检测，见表2。MIC均>128 μg/ml，表明异乌药内酯的对非H.pylori菌株抑制作用不明显，对H.pylori菌株的抑制作用明显优于以上20种细菌及真菌，可专一作用于H.pylori菌株。

表2 乌药成分异乌药内酯的对非H.pylori菌株的MIC检测

3 讨论

H.pylori在人类胃内普遍定植，并成为威胁全人类健康的明确致癌物，抗生素耐药性升高对根除造成严重影响，发现新药物成为迫切需要[12]。中药是我国传统的药材，目前已发现许多中药在抗菌领域中起到一定作用，常见于具有清热解毒功效的中药，例如黄芩、金银花、板蓝根、连翘等[8]。桓娜等[13]在针对乌药的中药学及其临床应用进行总结，发现乌药具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、镇痛及抗炎作用，同时对中枢神经、消化系统和预防糖尿病肾病起到有益作用。早在20世纪70年代就发现乌药具有抑制金黄色葡萄球菌、甲型溶血链球菌、伤寒沙门菌、变形杆菌、大肠埃希菌的作用[13]。后来张琳等[14]发现乌药对空肠弯曲菌也起到抑菌作用，但乌药成分异乌药内酯在抗菌中的研究鲜少见报道。通过本研究发现，乌药成分异乌药内酯具有较良好的抗H.pylori作用，其对敏感及耐药菌株MIC均在8～16 μg/ml之间，但对除H.pylori以外的细菌及真菌抑制作用远不及对H.pylori的抑制作用，表明异乌药内酯对H.pylori作用具有专一性。除了穿心莲内酯、苦地胆内酯、小白菊内酯等外，中药成分内酯类抗菌作用的报道比较少[15-17]，而且其作用机制基本不清楚，对细胞膜或生物膜的作用可能性比较大。乌药成分异乌药内酯特异性作用于H.pylori，这是非常值得探讨的问题，应该不单是对细胞膜或生物膜作用，否则其抗菌特异性不会这么高。本文在乌药中挖掘出异乌药内酯成分能专一抑制H.pylori，不仅对乌药的抗菌成分添加新认知，且为研发抗H.pylori的先导药物提供非常有意义的候选化合物。

综上所述，异乌药内酯对敏感和耐药的H.pylori均具有良好的抑制效果，可专一作用于H.pylori，具有较好的研发前景。