胚胎滞留-立即二次移植临床妊娠结局的回顾性病例匹配研究

李晓芳，师娟子，施文浩，柏海燕

(西北妇女儿童医院生殖中心，西安 710003)

胚胎移植(ET)是辅助生殖技术体外受精(IVF)后最关键的步骤。当ET结束时，若发现胚胎滞留则需再次移植。胚胎滞留会令患者沮丧及焦虑，也会影响移植医生的情绪，但胚胎滞留又无法完全避免。腹部B超引导可以改善IVF-ET助孕的临床妊娠结局，困难移植发生率和胚胎滞留率均显著降低，然而胚胎滞留率仍然可达0.3%～7.5%[1-3]。目前，导致胚胎滞留的原因尚不明确，可能的影响因素包括移植医生的经验、移植过程宫腔压力变化、移植导管被宫颈粘液阻挡或血液污染等[4-5]。由于胚胎滞留在辅助生殖助孕中的发生率较低，因此，胚胎滞留-立即二次移植临床结局的相关研究较少，并且不同研究间妊娠结局异质性较强。Visser等[6]研究发现，胚胎滞留-立即二次移植的临床妊娠率较低，建议胚胎滞留患者可推迟1 d后再行ET以提高临床妊娠率。Xu等[7]和Alvero等[8]研究发现，胚胎滞留-立即二次移植的临床妊娠率显著低于无胚胎滞留组。然而，Lee等[9]和Oraif等[1]研究发现，胚胎滞留-立即二次移植对临床结局并无显著影响。由此可见，辅助生殖助孕中胚胎滞留-立即二次移植对临床结局的影响仍有争议。因此，本研究拟通过对胚胎滞留-立即二次移植和无胚胎滞留患者进行回顾性病例1∶1匹配对照研究，探讨胚胎滞留的发生率以及胚胎滞留-立即二次移植对IVF-ET临床结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

收集2019年1月至2021年6月于我院生殖中心行IVF/ICSI助孕患者的临床资料。

纳入标准：(1)行IVF/ICSI助孕；(2)新鲜移植的周期和冻融胚胎移植(FET)周期；(3)临床及随访资料完整的周期。排除标准：(1)有精神疾病、严重心脑血管疾病等；(2)数据缺失以及失访周期。

共纳入28 089个移植周期。根据患者是否发生胚胎滞留进行分组，即胚胎滞留组(n=59)及非胚胎滞留组(n=28 030)。两组患者进一步进行1∶1病例匹配，匹配因素包括：(1)女性年龄(±1岁)；(2)移植胚胎数目、类型(囊胚或卵裂期胚胎)以及优胚数目；(3)促排卵方案或FET内膜准备方案；(4)授精方式；(5)不孕年限(±2年)；(6)移植医生的经验；(7)移植胚胎学家的经验。以上除了“移植胚胎学家”因素有部分病例不能完全匹配，其余1～6项匹配因素均为完全匹配。1∶1病例匹配后，胚胎滞留组和非胚胎滞留组各纳入59个周期。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)、穿刺取卵及授精：根据患者年龄、体质量指数(BMI)、基础窦卵泡数(AFC)以及基础性激素水平等选择适合的COH方案。动态监测卵泡发育情况及血清激素水平，促排卵一般持续约10 d左右。当有两个或两个以上的优势卵泡(直径≥18 mm)时，给予HCG诱发排卵，36 h后行B超引导下穿刺取卵术。之后行常规IVF或ICSI授精。

2.胚胎培养、评级：于37℃恒温、5%CO2、5%O2和90%N2条件下培养胚胎。受精后43～45 h观察卵裂期胚胎发育情况，91～120 h观察囊胚期胚胎并进行评级。卵裂期胚胎通过观察卵裂球数量、形态以及胚胎碎片率等进行综合评分。根据卵裂球数量分为4个等级：8～10细胞胚胎划分为I级，6～7或>10细胞被划分为Ⅱ级，5细胞被划分为Ⅲ级，<4细胞则划分为Ⅳ级；根据卵裂球细胞均匀性分为4个等级：卵裂球大小均匀且形态规则为I级，卵裂球大小略不均匀、形态略不规则为Ⅱ级，卵裂球大小不均匀、形态不规则为Ⅲ级；卵裂球大小极不均匀、形态极不规则为Ⅳ级；根据细胞碎片率分为4个等级：细胞碎片率<10%的为I级，细胞碎片率10%～20%的为Ⅱ级，细胞碎片率20%～30%的为Ⅲ级，细胞碎片率>30%为Ⅳ级。根据以上3个方面进行综合评级，将卵裂期胚胎划分为I～Ⅳ等级，Ⅳ级为废弃胚胎，I和Ⅱ级为优质胚胎，Ⅲ级为非优质胚胎[10]。囊胚评级亦通过囊胚扩张程度、内细胞团质量以及滋养外胚层质量3个方面进行综合评价，其中扩张程度3～5级≥BB的囊胚为优质囊胚，其余可用囊胚为非优质囊胚[11]。

3.胚胎移植术：移植前，患者需充盈膀胱，在腹部B超引导下进行。取膀胱截石位，充分暴露宫颈，用无菌棉签沾胚胎培养液清洗宫颈，腹部B超引导下置入1根移植外管，将胚胎及20 μl培养基加载至移植内管，为了方便移植时B超可视化，留5 μl左右气泡(B超下可看到亮点)，将内管通过外管置入，在子宫底约1 cm左右进行移植。移植后用培养基对移植管进行冲洗，并置于显微镜下观察冲洗液，若发现胚胎滞留，则立即进行二次移植。二次移植位置同第1次移植，若为部分胚胎滞留，二次移植位置略低于第1次移植位置。

4.ET：若无特殊情况(子宫内膜异位症、未处理的输卵管积水、宫腔黏连、孕酮升高等)均进行新鲜卵裂期胚胎或囊胚移植；若新鲜周期移植未妊娠、全胚冷冻或有冻存胚胎拟生育二胎患者，则进行FET。

5.妊娠结局判断：移植囊胚后12 d或移植卵裂期胚胎后14 d测血HCG，血HCG≥7 U/L为HCG阳性；孕6周B超下可见宫内孕囊为临床妊娠；HCG阳性患者孕6周未见宫内孕囊或临床妊娠患者孕12周前发生自然妊娠丢失的为早期流产。

6.观察指标：比较两组患者的一般资料及临床资料。一般资料包括：年龄、BMI、不孕年限、基础FSH(bFSH)、移植前子宫内膜厚度等；临床资料包括：胚胎种植率、HCG阳性率、临床妊娠率及早期流产率。胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%，HCG阳性率=HCG阳性周期数/移植周期数×100%，临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，早期流产率=早期流产周期数/HCG阳性周期数×100%。

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三、统计学分析

结 果

一、胚胎滞留发生基本情况

本研究纳入28 089个移植周期，其中11 987个周期为新鲜胚胎移植周期，16 102个周期为FET周期，总胚胎滞留率为0.21%(59/28 089)。新鲜移植周期的胚胎滞留率0.18%(22/11 987)与FET周期的胚胎滞留率0.23%(37/16 102)比较无显著性差异(P>0.05)；移植D3卵裂期胚胎的胚胎滞留率0.22%(19/8 463)与移植D5/D6囊胚的胚胎滞留率0.20%(40/19 626)比较无显著性差异(P>0.05)；移植≥2枚胚胎的胚胎滞留率0.35%(27/7 651)显著高于移植1枚胚胎的胚胎滞留率0.16%(32/20 438)(P<0.05)。本研究中发现胚胎滞留的患者均立即进行第2次移植，仅1例由于第2次移植后仍有胚胎滞留，进行了第3次移植。

二、病例1∶1匹配后两组患者的一般资料比较

根据匹配因素以1∶1匹配病例后，非胚胎滞留组和胚胎滞留组各纳入59个周期，各组中新鲜移植为22个周期，FET为37个周期。

两组间平均年龄、BMI、bFSH、不孕年限、内膜厚度以及移植周期数比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者的一般资料比较(-±s)

三、病例1∶1匹配后两组患者的妊娠结局比较

两组间胚胎种植率、HCG阳性率、临床妊娠率以及早期流产率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者的妊娠结局比较(%)

讨 论

在过去的几十年间，关于胚胎滞留-立即二次移植是否对IVF助孕结局有不良影响一直存在争议。因此，本研究严格按照病例1∶1匹配研究，对本中心胚胎滞留-立即二次移植的IVF/ICIS-ET助孕结局进行分析。

本研究共纳入28 089个胚胎移植周期，总胚胎滞留率为0.21%(59/28 089)，胚胎滞留率低于既往报道[1-2]。目前，胚胎滞留发生的原因尚不明确，可能的因素包括移植医生的经验、移植导管被宫颈粘液阻挡或血液污染等原因。既往文献提示，胚胎移植前去除宫颈管粘液会缩短插管时间并可显著提高临床妊娠率[12-13]。ET是辅助生殖助孕最后且关键的一步，本中心ET操作一般由3位有丰富临床经验的副主任医师以上级别医生进行，且移植前会对宫颈粘液进行充分清洗，放置胚胎位置在距离宫底1～1.5 cm处，为了避免刺激子宫收缩，尽量轻柔操作。本中心参与ET操作的临床医生以及胚胎学家评估的胚胎滞留情况基本一致，提示移植医生以及胚胎学家之间的质控基本没有差异。

既往文献多集中于分析卵裂期胚胎滞留-二次移植对临床结局的影响，而对移植囊胚-二次移植的胚胎滞留率及妊娠结局的研究相对较少。有研究发现，囊胚透明带在孵化时更加脆弱，ET操作可能会对囊胚造成一定程度的损伤，且D5/D6囊胚相较D3卵裂期胚胎体积更大，扩张后密度更低，移植D5/D6囊胚更容易发生胚胎滞留[9，14]。但本研究结果显示，移植D3卵裂期胚胎的胚胎滞留率与移植D5/D6囊胚比较无显著性差异(0.22% vs. 0.20%，P>0.05)，这与既往几篇文献[7，15-16]结果相符。Yi等[15]研究发现，单囊胚移植后无胚胎滞留发生，而移植2枚囊胚的胚胎滞留率为3.5%，提示移植胚胎数目越多发生胚胎滞留的风险越高；我们的研究结果与之一致，移植≥2枚胚胎的胚胎滞留率显著高于移植1枚胚胎(0.35% vs. 0.16%，P<0.05)。本研究结果还发现，FET周期的胚胎滞留率略高于新鲜移植周期，但尚无显著性差异(0.23% vs. 0.18%，P>0.05)，这与Lee等[9]的研究结果相符。

影响IVF助孕妊娠率的因素，包括女性年龄，移植胚胎数目、类型以及优胚数目、促排卵方案或FET内膜准备方案、授精方式、不孕年限及人为因素(移植医生及胚胎专家的经验)等，本研究为了减少这些可能因素的影响，进行了严格的病例1∶1匹配研究。通过严格的病例1∶1匹配后研究发现，胚胎滞留组的胚胎种植率、HCG阳性率、临床妊娠率及早期流产率与非胚胎滞留组比较均无显著性差异(P>0.05)，这与既往多篇研究[1，9]结果相符。

由于胚胎滞留事件的特殊性，仅能进行回顾性研究分析，本研究是单中心的回顾性研究，存在回顾性研究固有的缺陷和选择偏倚等问题；此外，本研究未对移植管粘液或血液污染进行分析，存在一定局限性。移植导管被粘液/血液污染与否对胚胎滞留发生的影响目前尚无明确结论，较早文献发现，移植导管无粘液/血液污染组的胚胎滞留率与有粘液/血液污染组比较无显著性差异，且当导管无粘液或血液污染时，胚胎滞留组的临床结局与非胚胎滞留组比较无显著性差异(P>0.05)[17]；但最近有文献提出，粘液/血液污染可能增加胚胎滞留的发生，且血液污染可能对妊娠结局带来一定负面影响[18]。移植导管被血液或粘液污染是否导致胚胎滞留并影响妊娠结局尚需要后续进一步深入探讨。

综上，本研究是目前胚胎滞留相关研究中纳入移植周期数较多的一项研究，且通过严格的病例1∶1匹配对照研究，结果显示胚胎滞留-二次移植对IVF/ICSI-ET的临床结局无明显影响；但胚胎滞留事件可能导致患者产生不良情绪，应尽量避免。另外，移植胚胎数目增多会增加胚胎滞留的风险，因此临床工作中仍推荐单胚胎移植，可以同时降低胚胎滞留和多胎妊娠的发生风险。