阿尔茨海默病患者血清miR-145表达水平及诊断价值研究

党玉婷 徐宇浩 徐建慧 周亚丽 于 明

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是以记忆力进行性下降为主要特征的最常见的慢性神经退行性疾病，病理特征为胞外神经炎性斑和胞内神经元纤维缠结形成[1]。近年来，AD诊疗领域的研究相继开展，但病理学结果依旧是诊断的金标准，在病理开展极度受限的临床局面下，便捷、无创的生物学标志物开发成为了AD研究的热点。部分miRNA在脑组织中特异性表达[2, 3]，并在血清中呈现出一致性变化，为相关血清标志物的研究提供了方向。近年来研究显示，miR-145可通过调节NR4A2参与AD的神经炎症和细胞死亡过程，在AD的起病和发展中发挥重要作用[4]。然而关于miR-145在AD患者血清中如何表达，尚未见报道及评估。因此，本研究以AD患者血清miR-145为观察指标，评估其在AD患者中的表达变化和诊断价值，以期为AD的诊断提供一个良好的辅助指标。

资料与方法

1.一般资料:选取2020年6～12月就诊于江苏大学附属医院神经内科门诊的36例初诊AD患者为AD组，另选取同期在医院体检的18例健康体检者为对照组。入组患者本人或法定监护人均对本研究知情，自愿签署知情同意书，本实验经江苏大学附属医院医学伦理学委员会批准通过(伦理审批号：SWYXLL20210401-112)。

纳入标准：①符合美国国立神经病及相关疾病学会(NINCDS/ADRDA)制定的“很可能的AD痴呆”诊断标准[5]；②MMSE评分为0～23分，临床痴呆量表评分≥0.5分，Hachinski缺血指数量表评分<4分；③头颅磁共振提示双侧颞叶、海马萎缩。排除标准：①其他疾病导致的痴呆或认知功能障碍者；②有药物滥用史者；③进行性原发性失语者；④既往有创伤性脑损伤者；⑤合并抑郁症、精神分裂症及心脏、肝脏、肾脏、造血系统严重疾病患者；⑥神志不清，不能配合者；⑦有其他不适宜入选的情况。

2.主要仪器及试剂:高速低温离心机(美国Thermo Fisher科技公司)；紫外分光光度仪(美国Beckman公司)；荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；血清miRNA提取分离试剂盒(天根生化科技有限公司)；miRNA第一链cDNA合成(山东思科捷生物技术有限公司)；miRNA荧光定量PCR试剂盒(山东思科捷生物技术有限公司)；人胰岛素生长因子1受体ELISA试剂盒(华美生物工程有限公司)。

3.方法:(1)标本采集:清晨采集受试者空腹外周血5ml于枸橼酸钠抗凝管内，4℃冰箱静置30min后，于4℃离心机以3000r/min离心15min，分离血清置于-80℃冰箱保存，用于后续检测。(2)治疗方案:AD组患者统一由一位神经专科医生指导临床用药，具体治疗方案如下：盐酸多奈哌齐初始剂量5mg，晚睡前口服，维持1个月；后继以10mg剂量，晚睡前口服，连续用药6个月。(3)神经心理学测试:由两位神经专科医生对AD组患者进行量表评估，采用简易精神状态检查(MMSE)、蒙特利尔认知功能评定(MoCA)量表进行认知功能评估。(4)引物设计及合成:引物由上海生物工程技术有限公司设计合成，采用茎环法合成引物。引物序列如下：miR-145上游引物：5′-CGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′，下游引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。内参U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。(5)RNA提取及定量检测:参照miRNA提取分离试剂盒说明书，提取血清中总miRNA，用紫外分光光度仪检测RNA的浓度和纯度，而后对RNA进行反转录反应，随之进行荧光定量PCR检测，按照试剂盒说明书配置25μl反应体系，反应条件：95℃，5min；继而95℃，10s；60℃，30s共40个循环；95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s；以U6作为内参基因，采用2-△△CT法计算miR-145相对表达量。(6)胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)水平测定:参照ELISA试剂盒说明书操作，采用酶联免疫吸附法检测血清IGF-1R表达水平。

结 果

1.AD组与对照组临床基线资料比较:AD组和对照组在性别、年龄、受教育程度、高血压病和糖尿病方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性；AD组MMSE、MoCA量表评分显著低于对照组(P<0.05)，详见表1。

表1 AD组和对照组一般临床资料比较

2.阿尔茨海默病组与对照组血清miR-145相对表达量比较：阿尔茨海默病组血清miR-145的相对表达量为3.26±1.79，对照组血清miR-145相对表达量为1.85±2.32，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)，详见图1。

图1 阿尔茨海默病组和对照组血清miR-145相对表达量比较

3.阿尔茨海默病组治疗前后血清miR-145相对表达量比较：阿尔茨海默病组在盐酸多奈哌齐治疗6个月后再次复测血清miR-145，治疗后AD组血清miR-145相对表达量为2.47±1.34，较治疗前(3.26±1.79)显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，详见图2。

图2 阿尔茨海默病组治疗前后血清miR-145相对表达量比较

4.血清miR-145表达水平与MMSE、MoCA量表评分相关性分析：MMSE和MoCA量表评分越低，提示患者的认知功能受损越严重，从miR-145表达水平和MMSE、MoCA量表评分散点图可看出，随着量表评分下降，miR-145表达呈上升趋势，相关性分析结果显示，血清miR-145表达水平与MMSE、MoCA量表评分呈负相关(r=-0.707，P<0.01；r=-0.687，P<0.01)，详见图3、图4。

图3 miR-145表达水平与MMSE量表评分相关性分析

图4 miR-145表达水平与MoCA量表评分相关性分析

5.血清miR-145表达水平对AD的诊断效能分析：应用ROC曲线评价血清中miR-145表达水平对AD的诊断价值，血清miR-145曲线下面积为0.773(95% CI：0.619～0.927，P<0.05)，敏感度为88.9%，特异性为66.7%，详见图5。

图5 miR-145对AD的诊断效能分析

6.IGF-1R与miR-145表达相关性分析：相关性分析结果显示，血清miR-145表达水平与IGF-1R呈负相关(r=-0.608，P<0.01)，详见图6。

图6 血清miR-145与IGF-1R表达水平相关性分析

讨 论

AD是导致痴呆最为常见的原因[6]。目前AD发病机制尚未完全阐明，早期药物治疗可以最大程度延缓疾病进展，但缺乏有效的防治措施，因此研究兴趣转向寻找早期生物学标志物[7]。近年来研究发现，部分miRNA在学习记忆、突触可塑性、神经系统发育及神经元分化增殖方面发挥重要作用，并参与AD发病相关基因的表达和调节[3,8]。De等[9]在神经胶质细胞中证实了miR-146参与了Aβ诱导的认知障碍和记忆功能减退，Sun等[10]则在AD细胞模型中揭示了miR-143-3p靶向NRG1对神经元存活的调控作用。尽管AD与miRNA的成果不断涌现，但相关研究仍在持续跟进中。miR-145作为miRNA家族的重要成员，既往研究多关注于肿瘤、心脑血管病、糖尿病等领域[11～13]。

随着研究的不断深入，Kye等[14]研究发现，miR-145在恐惧条件反射中显著上调，似乎已提示了miR-145可能在学习和记忆形成中发挥关键作用。随后，Jakaria等[4]研究发现，NR4A2在维持海马正常功能方面发挥重要作用，激活NR4A2可促进成年海马神经元发生，改善认知功能，而miR-145可能通过负性调控NR4A2导致认知障碍的加重，高度提示miR-145在AD发展过程中可能是一个危险因素[15]。在此基础上，评估了AD患者血清中miR-145的表达水平，发现miR-145在首诊AD患者中表达上调，在盐酸多奈哌齐治疗后患者血清中miR-145表达水平较治疗前下降，从临床层面揭示了miR-145升高对AD的发展起促进作用。

为了进一步评估miR-145与AD认知功能的相关性，笔者对miR-145与MMSE及MoCA量表分别进行相关分析，而miR-145与两者较高的相关系数提示miR-145对AD患者病情严重程度评估具有一定的提示作用。同时本研究探讨了miR-145对AD的诊断价值，结果显示ROC曲线下面积为0.773，敏感度和特异性均较高，提示miR-145在AD中具有一定的应用价值，有望成为AD临床辅助诊断的潜在生物学标志物。此外，miR-145对IGF-1R的调控作用已在多种疾病中进行报道，Maria等[16]研究发现，miR-145可通过调节IGF-1R参与胰腺导管腺癌的进展和转移，邴钟兴等[17]研究发现，miR-145靶向下调IGF-1R抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化进程。何强华等[13]在脑梗死患者血清中研究发现，miR-145与IGF-1R呈显著负相关。由此，笔者对miR-145与IGF-1R在AD患者中是否存在关联产生了极大兴趣，并对AD患者血清miR-145和IGF-1R进行相关性分析，两者显著的负相关关系亦高度提示miR-145和IGF-1R在AD发生、发展过程中可能存在着相互作用，推测miR-145可能通过抑制IGF-1R的翻译参与AD的发展。这也值得后期通过AD动物及细胞模型深入探讨。

综上所述，miR-145在AD患者血清中表达上调，对AD筛查具有一定的应用价值，有望为AD的临床辅助诊断及疗效评估提供新的靶点。本研究也存在诸多不足，如样本量较少、未获得中枢数据，miR-145和IGF-1R在AD基础层面研究仍待完善，相关研究需进一步研究予以证实。