THBS1在乳腺癌细胞中的表达及对生物学行为的影响

马若男 包楠丁 刘 霞 陈永霞 云 芬 施 琳 贾永峰

乳腺癌(breast cancer,BC)是一种严重危害女性健康的最常见恶性肿瘤，其特点为侵袭性强、复发率高、预后差，临床上主要通过手术和化疗治疗乳腺癌，但乳腺癌患者的长期生存率依然较低。因此，进一步探讨乳腺癌发生、发展的分子机制，对早期防治乳腺癌、提高患者生存质量有重要意义[1,2]。血小板凝血酶蛋白(thrombospondin ,THBS)是最初在血小板中发现的一种黏附性糖蛋白，在组织发生和重塑期间可调节细胞表型和细胞外结构，介导细胞-细胞之间和细胞-基质之间的相互作用[3]。作为THBS家族成员之一，三聚体糖蛋白THBS1在 1971年被发现。本课题组前期的研究结果表明，THBS1在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织，提示其可能在乳腺癌发生和恶化等过程中起到重要作用。

材料与方法

1.材料:人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231购自中国医学科学院；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基、OPTI-MEM培养基购自美国Gibco公司；4%多聚甲醛购自美国Sigma公司；DPBS磷酸盐缓冲液购自兰杰柯科技有限公司；THBS1-siRNA、阳性对照siRNA由苏州吉玛基因股份有限公司合成；qPCR反应预混试剂盒、RNA 抽提试剂盒、一步法gDNA去除和cDNA合成预混试剂盒、膜联蛋白V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、Cell Counting Kit 8(CCK-8)购自北京Trans Gen生物技术有限公司；Lipofectamine 3000 Reagent购自赛默飞世尔科技有限公司；1%结晶紫染色液、不含EDTA胰蛋白酶购自北京博奥森生物技术有限公司。

2.生物信息学分析:基因表达芯片数据来源于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中乳腺癌1222例样本(t:1109/n:113)，利用R软件的limma包及ggpubr包对THBS1做配对差异分析，即对于同一个样本在正常和肿瘤样本中配对表达的情况。

3.细胞培养:MCF-7细胞使用DMEM+10%胎牛血清(FBS)+1%青链霉素(P/S)培养，MDA-MB-231细胞使用RPMI-1640+10%FBS+1%P/S培养，细胞置于5% CO2、37℃恒温培养箱中，汇合度为80%～90%时进行传代，保持细胞良好的生长状态，取对数增长的细胞进行后续研究。

4.siRNA转染：转染前分别于24孔细胞培养板中接种两种细胞，每孔加入1ml细胞悬液，细胞密度约为5×104个/毫升，于37℃、5% CO2条件下培养24h，使转染时细胞汇合度为60%～80%。转染时将细胞分为空白对照组、si-NC组和si-THBS1组。空白对照组正常培养，si-NC组转染阴性对照siRNA，si-THBS1组转染THBS1- siRNA。si-NC阴性对照靶序列为：上游引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。si-THBS1干扰靶序列为：上游引物：5′-GCGUGAAGUGUACUAGCUATT-3′，下游引物：5′-UAGCUAGUACACUUCACGCTT-3′。转染过程严格按照Lipofectamine 3000 Reagent试剂盒说明书进行。

5.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR):转染后24h提取空白对照组、si-NC组和si-THBS1组的细胞样本提取RNA，反转录反应合成cDNA，进行qRT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性30s，94℃ 5s，60℃ 30s，循环40～45次。内参管家基因为GAPDH，结果严格按照试剂盒说明书进行判读。THBS1上游引物：5′-GCTCCAGCTCTACCAATGTCCT-3′，下游引物：5′-TTGTGGCCGATGTAGTTAGTGC-3′。GAPDH上游引物：5′-TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA-3′，下游引物：5′-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。THBS1相对表达量用 2-△△Ct表示，△Ct=CtTHBS1-CtGAPDH，△△Ct=△Ct样本-△Ct参考样本。

6.CCK-8细胞增殖实验：取转染后24h的各组细胞种植于96孔培养板中，每组均设置3个复孔，每孔加入100μl细胞悬液，MDA-MB-231细胞接种密度为3×103/孔，MCF-7细胞接种密度为5×103/孔，继续培养24h，使细胞汇合度为60%～80%，按照CCK-8试剂盒说明进行检测，分别在24、48、72h用酶标仪于450nm波长处检测细胞吸光度，并绘制生长曲线。

7.Transwell小室侵袭实验：实验前1天在0.8μm孔径的24孔Transwell小室上室内均匀注入50μl稀释浓度为1∶8的matrigel基质胶，室温孵育过夜。消化收集转染后24h的各组细胞，用无血清培养基调整细胞密度为1×105个/毫升，各接种100μl细胞悬液于Transwell小室上室内，下室各加入600μl完全培养基。继续培养36h，取出上室，用棉签擦去上室内侧未穿透的细胞，4%多聚甲醛固定，1%结晶紫染色液染色，于显微镜下每个小室随机选取5个视野观察并拍照记录，计算细胞数目均值。

8.流式细胞学检测：收集已转染24h后的细胞培养液，用不含EDTA胰蛋白酶消化细胞，预冷的DPBS重悬，计数并收集1×106个细胞。按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒操作说明进行实验，各组细胞均设置3个对照组：阴性对照细胞、凋亡阳性细胞、凋亡阴性细胞。阴性对照细胞不加任何染料；凋亡阳性细胞单染Annexin V-FITC，不加PI；凋亡阴性细胞单染PI，不加Annexin V-FITC。用流式细胞仪完成检测。

结 果

1.生物信息学分析乳腺癌组织与正常组织中THBS1表达差异:使用TCGA数据库对同一个乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织样本中THBS1单基因配对表达分析，差异有统计学意义(P<0.05)，THBS1在乳腺癌组织中的表达量高于癌旁组织(图1)。

图1 TCGA数据库中乳腺癌患者THBS1单基因配对差异分析

2.si-RNA转染情况:转染si-RNA后，荧光显微镜下观察，可见Cy3红色荧光基团标记于细胞质，随机选取5个高倍视野，计数成功转染细胞数/细胞总数>80%，满足实验要求(图2)。

3.si-THBS1对细胞中THBS1 mRNA表达水平的影响:qRT-PCR检测结果(图3)显示，与空白对照组和si-NC组比较， si-THBS1转染的THBS1mRNA表达量明显降低，对MDA-MB-231细胞的沉默效率为62.9%±2.9%，对MCF-7细胞的沉默效率为94.98%±0.37%，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 siRNA转染两种细胞的转染效率(×200)A.MDA-MB-231细胞；B.MCF-7细胞

图3 qPCR检测THBS1 mRNA相对表达A.MDA-MB-231细胞；B.MCF-7细胞

4.CCK-8细胞增殖实验检测si-THBS1对细胞增殖能力的影响：与空白对照组及si-NC组比较，MCF-7细胞的si-THBS1组增殖能力受到抑制，差异有统计学意义(P<0.05)；MDA-MB-231细胞各处理组之间细胞增殖能力比较，差异无统计学意义(P>0.05,图4)。

图4 si-THBS1对两种细胞增殖能力的影响A.MDA-MB-231细胞；B.MCF-7细胞

5.Transwell小室侵袭实验检测si-THBS1对细胞侵袭能力的影响：两种乳腺癌细胞的si-THBS1组细胞侵袭个数低于si-NC组，差异有统计学意义(P<0.05,图5)。

图5 si-THBS1对两种细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×200)A.MDA-MB-231细胞si-NC组；B.MDA-MB-231细胞si-THBS1组；C.MCF-7细胞si-NC组；D.MCF-7细胞si-THBS1组；E.MDA-MB-231侵袭细胞个数；F.MCF-7侵袭细胞个数

6.流式细胞学实验检测细胞凋亡率:两种乳腺癌细胞si-NC组凋亡率均低于si-THBS1组，差异有统计学意义(P<0.05，图6)。

图6 si-THBS1对两种细胞凋亡率的影响A.MDA-MB-231细胞si-NC组；B.MDA-MB-231细胞si-THBS1组；C.MCF-7细胞si-NC组；D.MCF-7细胞si-THBS1组；E.MDA-MB-231细胞凋亡率；F.MCF-7细胞凋亡率

讨 论

THBS1作为一种多功能的糖蛋白，在成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和树突状细胞等多种细胞中均有表达，其生物学效应包括调节CD36、CD47、TGF-β1的信号通路、抑制血管生成、参与组织修复等[4,5]。据相关报道，THBS1在黑色素瘤、甲状腺癌、食管鳞状细胞癌、肺腺癌、乳腺癌中表达增高，在前列腺癌、胶质瘤、宫颈癌等肿瘤中表达降低[6～10]。肿瘤组织中THBS1的差异性表达提示其对肿瘤的生长、黏附和迁移有一定的影响[11]。现有证据表明THBS1既能介导抑癌行为，又能介导促癌行为。Ahmed 等[12]研究证实，THBS1可与CD36或CD47相互作用，阻碍内皮细胞迁移并诱导其凋亡，抑制血管的生成进而延缓肿瘤的发生、发展。THBS1还可通过阻止细胞外基质释放VEGF、阻碍VEGF信号转导等多种途径拮抗VEGF的功能，从而发挥抗血管生成作用。另有研究表明，THBS1作为TGF-β1的激活剂，可以调控TGF-β1参与的肿瘤EMT进程，同时可促进肿瘤细胞VEGF的分泌使血管生成增多，促进癌症的进展[13]。THBS1对癌症的双重作用可能取决于特定的组织器官和微环境，在不同微环境中可能因不同结构域与不同受体结合而发挥不同的功能。

关于THBS1在乳腺癌中的作用，国内外研究者已开展大量研究，但在乳腺癌中THBS1的表达与患者预后之间的关系存在相互矛盾的结果。现有研究表明在正常乳腺组织或乳腺良性病变中THBS1不表达或低表达，而在乳腺癌组织中表达量升高[14～16]。这与本研究利用TCGA数据库得到的生物信息学分析结果一致。不同乳腺癌组织的表达量也不同，原位癌中THBS1仅表达于癌周基质细胞，而在浸润性导管癌和浸润性小叶癌的癌细胞胞质和间质中高表达，由此可以推测，早期癌细胞中的THBS1抑制血管生成，随着癌症进展，肿瘤侵袭性增加，肿瘤细胞长时间暴露于大量THBS1环境中，导致THBS1激活TGF-β1，促进肿瘤EMT的进程，同时促进肿瘤细胞分泌VEGF进而促进血管生成，抑制了THBS1本身对血管生成的抑制作用，表现为促癌作用。

为了探究THBS1在乳腺癌细胞中的作用，本实验选取MDA-MB-231和MCF-7细胞为实验材料。乳腺癌按照雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progestogen receptor, PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2, HER-2)3个受体的表达情况可分为三阴乳腺癌和非三阴乳腺癌。与非三阴乳腺癌比较，三阴乳腺癌恶性程度高，预后差。为了研究的严密性，选取的MDA-MB-231为三阴乳腺癌细胞，MCF-7为ER阳性的非三阴乳腺癌细胞。使用siRNA介导的基因干扰技术沉默THBS1基因并进行细胞功能实验，两种细胞THBS1基因表达均显著降低，其中MDA-MB-231干扰效率低于MCF-7细胞。这可能与THBS1在两种细胞中的表达量不同有关，THBS1在MDA-MB-231细胞中高表达[16]。CCK-8实验显示MCF-7细胞增殖能力显著下降而MDA-MB-231细胞未见明显差异，Transwell小室基质侵袭实验显示THBS1基因表达降低后两种细胞侵袭能力均减弱，且MCF-7细胞减弱程度更明显，说明THBS1可能抑制MCF-7细胞增殖，促进两种细胞侵袭能力。Marcheteau等[17]的研究显示了类似的结果，THBS1敲除的小鼠乳腺癌4T1细胞体外增殖能力无显著变化，而侵袭能力下降，并导致小鼠肺转移播散减少。THBS1基因沉默对各组细胞的凋亡促进情况比较，差异无统计学意义，表明THBS1在两种乳腺癌细胞中均可发挥抑制细胞凋亡的作用。总而言之，本研究证实THBS1可能在乳腺癌中扮演促癌角色，与Shen等[18]研究结果一致。

本研究总体样本量较小，实验未能探究THBS1在乳腺癌中发挥作用的具体机制及在不同类型乳腺癌中的作用是否有差异，仍需开展后续研究深入探讨。THBS1介导癌症的能力有望使其成为癌症新的预后标志物和诊疗的潜在靶点，进一步探索其调控乳腺癌的通路，是接下来研究的方向和重点。