不同剂量Collinsella aerofaciens菌对C57BL/6J小鼠血糖血脂代谢水平的影响

杨 浩 姜 雯 张裕祥 李琳琳 王蟾月 王 烨

近年来，研究人员发现肠道菌群平衡有助于人类宿主的正常代谢，而肠道菌群结构失衡可能会导致多种常见代谢性疾病的发生、发展，包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心脏代谢疾病和营养不良等[1，2]。高通量多组学数据(包括宏基因组学和代谢组学数据)的联合分析，对肠道菌群结构变化和其如何影响宿主代谢具有重要意义。Gou等[3]在分析2型糖尿病风险相关的核心肠道菌群中，将有和无2型糖尿病人群粪便通过粪菌移植，分别转接至无菌小鼠体内，揭示了与增加2型糖尿病风险相关的一组肠道微生物群及其特征。本课题组前期通过二代高通量测序法对糖耐量正常人群和2型糖尿病患者肠道菌群分析发现，Coriobacteiaceae菌科水平在两组人群中比较差异有统计学意义[4]。随后，本课题组从人群中分离并鉴定出一株来源于Coriobacteiaceae菌科的Collinsellaaerofaciens菌[5]。与Gou等[3]研究不同，笔者将Collinsellaaerofaciens菌回接至C57BL/6J小鼠体内，初步探讨单一肠道细菌对宿主血糖、血脂代谢水平的影响，从肠道菌群出发，为防治血糖血脂异常代谢提供思路。

材料与方法

1.实验动物:从北京维通利华实验动物技术有限公司购买6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPF级)共40只，实验动物许可证：SCXK(新)2018-0002。将购买的小鼠分笼饲养于新疆医科大学动物实验中心标准饲养间。适应性喂养1周后按照体质量随机分为4组，即对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只。对照组小鼠予以100微升/只的0.9%NaCl注射液，其余各组予以不同剂量的菌液100微升/只，每日1次，连续灌胃12周。

2.菌液制备:目标菌由本实验室从人群粪便中培养分离获得，并鉴定为Collinsellaaerofaciens菌[5]。使用0.9%NaCl注射液将Collinsellaaerofaciens菌配置成低剂量、中剂量和高剂量菌液(106CFU/100μl、108CFU/100μl和1010CFU/100μl)[6]。

3.药品与试剂:人常规胰岛素(美国Lily公司，批号:C96172A)，血糖测定试剂盒(中生北控生物科技有限公司，批号:151721)，总胆固醇测定试剂盒(中生北控生物科技有限公司，批号:161941)，甘油三酯测定试剂盒(中生北控生物科技有限公司，批号:161955)，高密度脂蛋白胆固醇(南京建成生物工程研究所，批号:20180129)，低密度脂蛋白胆固醇(南京建成生物工程研究所，批号:20180130)。

4.仪器: BSA224S电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，AC-S型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，微量加样器(芬兰Thermo 公司，Finnipette白色系列)，CoDa型全自动酶标仪(美国Bio-RaD公司)，MLS-3750型高压蒸汽灭菌器(日本SANYO公司)，DNp-9082型电热恒温箱(上海精宏实验设备有限公司)。

5.血糖、血脂代谢水平检测:每组小鼠于第0、4、8和12周取尾尖血，采用COD-pAp法测定血浆总胆固醇和甘油三酯水平，空腹血糖和随机血糖采用葡萄糖氧化酶法检测。于第12周处理小鼠后，收集血浆，严格按照高、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒检测各指标。每周称取小鼠体质量。

6.口服糖耐量及胰岛素耐量试验:口服糖耐量实验：于晚10：00时撤去各组小鼠饲料，更换普通饮水，次日晨10：00时，给予每只小鼠葡萄糖溶液(2g/kg)灌胃[7]，分别于0、30、60、120min取尾尖血，采用葡萄糖氧化酶法测定小鼠各时刻血糖水平。胰岛素耐量实验：于晚10：00时撤去各组小鼠饲料，更换普通饮水，次日晨8：00时给予每只小鼠按0.5U/kg的剂量皮下注射人常规胰岛素，分别于0、40、90、120min取尾尖血，采用葡萄糖氧化酶法测定小鼠各时刻血糖水平。计算第0、4、8和12周各组小鼠OGTT和ITT曲线下面积，探讨Collinsellaaerofaciens菌对小鼠血糖的影响。

结 果

1.Collinsellaaerofaciens菌对小鼠体质量的影响:称量各组小鼠每周体质量，0～12周，与对照组比较，低、中和高剂量组小鼠体质量均无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05，图1)。

图1 各组小鼠12周体重变化

2.空腹血糖及随机血糖变化: 在第0、4、8和12周，与对照组比较，低、中和高剂量组小鼠空腹血糖、随机血糖均无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05，图2、图3)。

图2 各组小鼠空腹血糖变化

图3 各组小鼠随机血糖变化

3.口服糖耐量及胰岛素耐量血糖变化: 在第0、4、8和12周，与对照组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠口服糖耐量及胰岛素耐量血糖曲线下面积无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05，图4、图5)。

图4 各组小鼠口服糖耐量曲线下面积变化

图5 各组小鼠胰岛素糖耐量曲线下面积变化

4.总胆固醇和甘油三酯水平变化:检测总胆固醇水平，在第0周和第4周，与对照组比较，低、中和高剂量组小鼠的总胆固醇无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。在第8和12周，与对照组比较，中和高剂量组小鼠的血浆总胆固醇明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组小鼠血浆总胆固醇无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05，图6)。检测甘油三酯在第0、4、8和12周，与对照组比较，低剂量组、中剂量和高剂量组小鼠的血浆甘油三酯均无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05，图7)。

图6 各组小鼠总胆固醇水平变化与对照组比较，*P<0.05

图7 各组小鼠甘油三酯水平变化

5.高、低密度脂蛋白胆固醇变化:给予小鼠Collinsellaaerofaciens菌12周后，处理小鼠，收集血浆，检测小鼠血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，与对照组比较，低和高剂量组小鼠血浆HDL-C水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05，图8)；中剂量组小鼠血浆HDL-C水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，低剂量组小鼠血浆LDL-C水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；中和高剂量组小鼠血浆LDL-C水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图8 各组小鼠高、低密度脂蛋白胆固醇水平变化与对照组比较，*P<0.05

讨 论

肠道菌群是宿主代谢的重要调节剂。2型糖尿病患者和健康人群肠道菌群有所不同，其中葡萄糖代谢受损与产丁酸盐细菌水平降低有关[8]。肠道菌群产生的代谢产物，例如短链脂肪酸，氨基酸衍生物和胆汁酸等，参与代谢和免疫过程，提示肠道菌群与葡萄糖稳态之间存在联系[9]。本课题组前期采用16S rDNA gene实时荧光定量PCR技术检测糖耐量正常人群及2型糖尿病患者肠道菌群，发现肠道菌群在糖耐量正常人群及2型糖尿病患者中存在显著差异[10，11]。同时本课题组前期从2型糖尿病患者粪便中分离培养出气单胞菌，回接至小鼠体内8周，结果发现该菌可以增加小鼠体质量，诱发小鼠糖耐量受损[12]。上述研究提示，肠道菌群与机体血糖血脂代谢存在联系。本研究在课题组前期工作基础上，继续探讨Collinsellaaerofaciens菌与血糖血脂代谢的关系[3]。

肠道微生物群的组成可以影响机体糖脂代谢。Lahti等[13]研究发现，Collinsella菌属和血清胆固醇水平呈正相关。Khan等[14]研究发现，在高胆固醇血症患者肠道中与动脉粥样硬化相关的Collinsella菌属相对丰度较高。上述结果说明Collinsella菌属可能与胆固醇变化相关。Gomez-Arango等[15]通过16S rRNA测序评估超重和肥胖孕妇粪便中微生物群，发现Collinsella菌属丰度与甘油三酯和极低密度脂蛋白胆固醇水平呈正相关，而与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关。本研究中将人群粪便中分离的Collinsellaaerofaciens菌回接至C57BL/6J小鼠体内，观察该菌对血糖血脂代谢的影响，发现该菌的中和高剂量可以在第8、12周明显升高小鼠血浆总胆固醇水平。此外，该菌的中和高剂量可以明显升高小鼠LDL-C水平，而中剂量还可明显降低小鼠HDL-C水平。本研究结果和上述文献报道基本一致，提示Collinsellaaerofaciens菌与血脂异常代谢存在相关性[13～15]。

肠道菌群组成结构比例变化及其代谢产物异常是导致胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血脂异常等的重要原因之一[16]。肠道菌群结构的失衡可能通过以下几个作用机制影响心血管疾病，包括：①肠道细菌内毒素移位，促进炎性细胞因子释放而导致炎性反应；②肠道菌群结构的失衡诱发物质代谢异常，如脂质和色氨酸代谢等；③肠道菌群结构的失衡加剧机体氧化应激反应[17]。肠道微生物中革兰阴性条件致病菌数量增多，可显著增加内毒素脂多糖(LPS)水平，降低肠紧密连接蛋白 1和封闭蛋白的表达，破坏肠黏膜屏障功能，导致细菌移位，产生大量 LPS 到血液中，引发炎性反应[18]。Baskar 等[19]在研究类风湿关节炎相关细菌与肠黏膜屏障的关系时发现，Collinsellaaerofaciens菌与肠黏膜屏障通透性增加密切相关。稳定的肠黏膜屏障可延缓或抑制心血管疾病的发生、发展。除了血脂异常外，炎性反应可能也是导致动脉粥样血管硬化等心血管疾病的重要因素。胆固醇、脂肪酸和修饰的脂质可以直接激活炎症途径。反之亦然，促炎性信号转导(即细胞因子)直接影响脂质代谢[20]。另有文献报道Collinsellaaerofaciens菌参与促炎性免疫反应，诱发机体炎症[21]。因此，本研究推测Collinsellaaerofaciens菌引发小鼠血脂代谢异常可能与其引发宿主肠黏膜屏障破坏，诱发炎性反应有关。

此外，本研究还发现不同剂量的Collinsellaaerofaciens菌在诱发小鼠血脂代谢异常变化中不成剂量依赖性，其中中剂量菌在引发小鼠HDL-C水平降低较高剂量明显。Udayappan等[6]在给予db/db小鼠口服Eubacteriumhallii菌改善胰岛素敏感度研究中，发现Eubacteriumhallii菌也不呈剂量依赖性，其中与较低剂量比较，高剂量改善胰岛素敏感度的影响较小，并推测其可能与这些高浓度细菌菌株(>1010CFU)在肠道中引起拥挤效应有关。

综上所述，本研究发现从人粪便中分离的Collinsellaaerofaciens菌可诱发小鼠血脂代谢异常，初步论证肠道微生物与血脂代谢的关系，为血脂代谢异常的研究及新药开发提供思路。