LncRNA DLX6-AS1通过miR-181b/IL-6轴影响食管癌细胞的恶性生物学行为

苏莹 马丽丽 柳江

在我国，食管癌死亡率仅次于胃癌、肺癌和肝癌[1]。早期手术切除是提高食管癌患者存活率的主要方法，但早期食管癌症状并不明显，大多数患者确诊时因处于晚期而失去手术切除机会，预后较差[2]。既往研究已证实长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）在包括食管癌在内的恶性肿瘤发生发展、治疗及预后中具有重要作用，参与调控细胞增殖、迁移和侵袭等一系列生物学过程[3-5]。同源盒转录因子6反义RNA1（homeobox transcription factor 6 antisense RNA1，DLX6-AS1）是位于人类染色体7q21.3的lncRNA。研究显示，lncRNA DLX6-AS1在肝癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌等多种肿瘤组织中均表达上调，且参与肿瘤细胞侵袭及转移过程[6-7]，因此认为其可能作为致癌基因发挥作用。本课题组前期通过DIANA-LncBase软件分析发现lncRNA DLX6-AS1与miR-181b存在靶向结合位点，另有研究报道miR-181b可靶向抑制白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达[8]。但三者在食管癌中的作用及其机制尚不清楚。本研究将通过体外研究初步探讨三者的相互潜在关系以及lncRNA DLX6-AS1/miR-181b/IL-6轴对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，旨在阐明食管癌发生发展的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人食管上皮细胞株HEEC和人食管鳞状细胞癌细胞株Eca-109均购自美国典型培养物保藏中心；胎牛血清购自杭州四季青公司；青霉素、链霉素、胰酶和DMEM培养基均购自美国Gibco公司；TurboFectTM转染试剂盒购自美国Thermo scientific公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒和Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA assay试剂盒购自美国ABI公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒购自日本Takara公司；CCK-8试剂盒和EdU细胞增殖检测试剂盒购自北京索莱宝生物公司；Transwell小室和Matrigel胶购自美国BD公司；BCA蛋白检测试剂盒、ECL发光液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒和结晶紫染色液均购自上海碧云天生物研究所；IL-6抗体（21865-1-AP）和GAPDH抗体（10494-1-AP）均购自中国Proteintech公司；羊抗兔二抗（14708）购自美国CST公司；pcDNA-3.1 NC、pcDNA-IL-6、lncRNA DLX6-AS1的 siRNA序列si-DLX6-AS1及其对照组序列si-NC、DLX6-AS1和IL-6野生型和突变型的报告基因载体均由广州锐博生物科技有限公司合成与构建。引物序列由上海生工生物工程公司合成。

1.2 细胞培养

将冻存的HEEC细胞和Eca-109细胞复苏，分别接种至含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基，并置于37℃、5% CO2条件下的培养箱中进行培养，待细胞生长融合度达到90%左右时，用胰酶消化，常规传代培养。

1.3 细胞转染与分组

取对数生长期的Eca-109细胞，以2×105/孔接种在6孔板中，并置于37℃、5% CO2的培养箱中过夜培养。分别将si-DLX6-AS1、si-NC、mimics NC、miR-181b mimics、pcDNA-3.1 NC、pcDNA-IL-6以及pcDNA-IL-6+miR-181b mimics转染至Eca-109细胞，并依次记为si-DLX6-AS1组、si-NC组、mimics NC组、miR-181b mimics组、pcDNA-3.1 NC组、pcDNA-IL-6组、pcDNAIL-6+miR-181b mimics组。转染方法：将5 nmol si-DLX6-AS1、miR-181b mimics分别用250 μL无菌水制成终浓度为50 μmol/L存储液；然后按照TurboFectTM体外转染试剂盒操作，将5 μL IMAX溶于250 μL Opti-MEM无血清培养基，同时将5 μL的50 μmol/L si-DLX6-AS1或50 μmol/L miR-181b mimics溶于250 μL Opti-MEM无血清培养基，混匀两种稀释液，室温下静置20 min；按照分组在各孔细胞中加入对应复合物500 μL，培养48 h后，收集各组细胞样品。pcDNAIL-6与miR-181b mimics共转染时，分别取5 μL的50 μmol/L miR-181b mimics溶于 250 μL Opti-MEM无血清培养基，0.5 μg pcDNA-IL-6 溶于 50 μL Opti-MEM无血清培养基，其余操作步骤同上。

1.4 qRT-PCR检测目的基因的表达

根据Trizol法提取各组细胞中的总RNA，用Nanodrop测定RNA纯度和浓度，然后通过TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒反转录获得miRNA的cDNA，并以PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser从总RNA中去除基因组DNA后反转录获得mRNA的cDNA。使用miRNA检测试剂盒TaqMan MicroRNA assay测定miR-181b的表达，扩增条件：95℃、10 min，1次循环；95℃、15 s，62℃、1 min，40次循环；使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒检测lncRNA DLX6-AS1和IL-6的表达，扩增条件：95℃、10 min，1次循环；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，35次循环。以U6作为miRNA的内参基因，GAPDH作为lncRNA DLX6-AS1和IL-6的内参基因，具体引物序列如下：miR-181b上游 5'-AAAACATTCATTGCTGTCG-3'，下游5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 上游 5'-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3'，下游 5'-AACCGCTTCACGAATTTGCGT-3ʹ；lncRNA DLX6-AS1上游5'-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3'，下游5'-ATTGACATGTTAGGGCCCTT-3'；IL-6 上游 5'-AACGATGATGCACTTGCAGA-3'，下游5'-GAGCATTGGAAATTGGGGTA-3'；GAPDH上游5'-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3'，下游 5'-AGGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。扩增结束后，通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.5 CCK-8法检测Eca-109细胞的增殖能力

收集转染后的各组Eca-109细胞，按1×104/孔接种在96孔板中，并置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，分别在培养24 h、48 h、72 h时加入10 μL CCK-8试剂液，混合均匀，继续孵育4 h，采用全自动酶标仪测定每组细胞450 nm处的光密度（OD）值。

1.6 EdU染色检测Eca-109细胞的增殖情况

收集转染后的各组Eca-109细胞，按1×105/孔接种在24孔板中，并置于37℃、5% CO2的培养箱中过夜培养，次日更换为含10 μmol/L EdU染液的培养基继续孵育2 h，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室温固定30 min，2 mg/mL甘氨酸摇床孵育5 min，PBS清洗；加入0.5% Triton X-100摇床孵育10 min，再用PBS清洗细胞；加入DAPI，室温避光孵育10 min后，用PBS清洗，甘油封片。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞染色情况。随机选择5个视野，计数该视野下EdU标记的阳性细胞数目与总细胞数目，并计算EdU阳性细胞率。EdU阳性细胞率（%）=（EdU阳性细胞数目/总细胞数目）×100%。

1.7 Transwell小室实验检测Eca-109细胞的迁移和侵袭能力

Transwell小室实验检测细胞侵袭时，预先取适量稀释后的Matrigel胶均匀加在Transwell小室上室的底部，并置于37℃培养箱中使其凝固。将转染后的各组Eca-109细胞调整为2×104/mL的细胞悬液，取100 μL细胞悬液加在预先用Matrigel胶包被好的Transwell小室上室中，下室加入600 μL含10% FBS的新鲜培养基，并置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育；24 h后，取出小室，去除上室内细胞，用4%多聚甲醛室温固定10 min，0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗后，封片。采用光学显微镜观察并统计染色穿膜细胞数。Transwell小室实验检测细胞迁移的操作步骤除了不铺Matrigel胶，其余同侵袭实验。

1.8 双荧光素酶报告基因实验验证基因的靶向关系

在报告载体pmirGLO上插入野生型DLX6-AS1、突变型DLX6-AS1的3'UTR端序列和野生型IL-6、突变型IL-6的3'UTR端序列，构建含miR-181b结合位点的DLX6-AS1野生型及突变型（DLX6-AS1 WT和DLX6-AS1 MUT）和IL-6野生型及突变型（IL-6 3'UTR WT和IL-6 3'UTR MUT）的报告基因载体。将对数生长期的Eca-109细胞以1×105/孔接种至12孔板上，通过Lipofectamine 2000脂质体转染试剂将双荧光素酶重组质粒分别与mimics NC或miR-181b mimics共转染至细胞，于37℃、5% CO2的培养箱中转染48 h后，收集细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明测定各组细胞的荧光素酶活性。

1.9 Western blot检测IL-6的表达情况

在Eca-109细胞中加入RIPA缓冲液，提取总蛋白，并按照BCA法测定蛋白样品浓度。将蛋白置于沸水浴中煮沸10 min，并制备12% SDS-PAGE，上样蛋白后经电泳分离2 h，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜，加入兔抗IL-6多克隆抗体（稀释比例为1∶1 000），4℃孵育过夜；次日，TBST洗膜，加入对应二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育1 h。TBST洗膜后，用ECL显色，凝胶成像系统扫膜拍照，Image-Pro Plus 6.0软件分析蛋白条带灰度值。以GAPDH作为内参蛋白，计算目的蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析与作图。计量资料均以均数±标准差（）表示，两组数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌Eca-109细胞中lncRNA DLX6-AS1、miR-181b及IL-6的表达情况

qRT-PCR检测结果显示，与HEEC细胞相比，Eca-109细胞中lncRNA DLX6-AS1、IL-6 mRNA的表达水平均显著升高（P=0.005，0.006），而miR-181b的表达水平显著下降（P=0.004），见图1。

图1 qRT-PCR检测lncRNA DLX6-AS1、miR-181b和IL-6在HEEC和Eca-109细胞中的表达情况Fig.1 Expression of lncRNA DLX6-AS1,miR-181b and IL-6 in HEEC cells and Eca-109 cells detected by qRT-PCR

2.2 LncRNA DLX6-AS1对食管癌Eca-109细胞增殖、迁移及侵袭的影响

qRT-PCR检测结果显示，与si-NC组比较，si-DLX6-AS1组中lncRNA DLX6-AS1表达水平显著下降（P=0.003），见图2A。表明下调lncRNA DLX6-AS1表达的Eca-109细胞模型构建成功。CCK-8检测结果显示，与si-NC组比较，si-DLX6-AS1组在48 h和72 h时的细胞增殖活性明显受到抑制（P=0.012，0.003），见图2B；EdU染色实验结果显示，si-NC组有大量EdU阳性细胞表达，而si-DLX6-AS1组中EdU阳性细胞率显著降低（P=0.007），见图2C。Transwell小室实验结果显示，与si-NC组比较，si-DLX6-AS1组细胞迁移数目与侵袭数目均减少（P=0.008，0.003），见图2D。

图2 LncRNA DLX6-AS1对Eca-109细胞增殖、迁移及侵袭的影响Fig.2 Effects of lncRNA DLX6-AS1 on the proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells

2.3 LncRNA DLX6-AS1与miR-181b的关系验证

DIANA-LncBase软件分析结果显示，lncRNA DLX6-AS1与miR-181b存在互补结合位点，见图3A。通过双荧光素酶报告基因实验验证靶向关系，结果显示，miR-181b mimics+DLX6-AS1 WT共转染组的荧光素酶活性显著低于mimics NC+DLX6-AS1 WT共转染组（P=0.006）；而miR-181b mimics+DLX6-AS1 MUT共转染组的荧光素酶活性与mimics NC+DLX6-AS1 MUT共转染组比较，差异无统计学意义（P=0.683），见图3B。qRT-PCR检测结果显示，转染si-DLX6-AS1的Eca-109细胞中miR-181b表达水平显著高于si-NC组（P=0.010），见图3C。

图3 LncRNA DLX6-AS1与miR-181b的关系验证Fig.3 Validation of the relationship between lncRNA DLX6-AS1 and miR-181b

2.4 miR-181b与IL-6的关系验证

采用miRanda软件进行预测，结果发现miR-181b与IL-6的3'UTR存在互补结合位点，见图4A。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-181b mimics+IL-6 3'UTR WT共转染组的荧光素酶活性显著低于mimics NC+IL-6 3'UTR WT共转染组（P=0.010），但miR-181b mimics+IL-6 3'UTR MUT共转染组与mimics NC+IL-6 3'UTR MUT共转染组的荧光素酶活性差异无统计学意义（P=0.712），见图4B。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与mimics NC组比较，miR-181b mimics组细胞中IL-6 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低（P=0.008，0.005）；pcDNA-IL-6组细胞中IL-6 mRNA和蛋白的表达水平均明显高于pcDNA-3.1 NC组（P=0.007，0.003），而pcDNA-IL-6+miR-181b mimics组细胞中IL-6 mRNA和蛋白的表达水平均显著低于pcDNAIL-6组（P=0.011，0.007），见图4C～D。

图4 miR-181b与IL-6的关系验证Fig.4 Validation of the relationship between miR-181b and IL-6

2.5 miR-181b调控IL-6影响食管癌Eca-109细胞增殖、迁移及侵袭

CCK-8检测结果显示，转染48h和72h时，miR-181b mimics组的细胞增殖活性均低于mimics NC组（P=0.023，0.012），而pcDNA-IL-6组细胞增殖活性均高于pcDNA-3.1 NC组（P=0.027，0.015）和pcDNA-IL-6+miR-181b mimics组（P=0.024，0.011），见图5A。

图5 miR-181b调控IL-6对Eca-109细胞增殖、迁移及侵袭的影响Fig.5 Effects of miR-181b on the proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells by regulating IL-6

EdU染色结果显示，各组细胞中均有EdU阳性细胞表达，其中miR-181b mimics组的EdU阳性细胞率较mimics NC组降低（P=0.012），而pcDNA-IL-6组的EdU阳性细胞率高于pcDNA-3.1 NC组（P=0.018）和pcDNA-IL-6+miR-181b mimics组（P=0.021），见图5B。

Transwell小室实验检测结果显示，miR-181b mimics组细胞迁移和侵袭数目均低于mimics NC组（P=0.018，0.017）；而pcDNA-IL-6组迁移与侵袭细胞数目均高于pcDNA-3.1 NC组（P=0.024，0.027）和pcDNAIL-6+miR-181b mimics组（P=0.031，0.029），见图5C。

3 讨论

近年来，尽管食管癌的诊断和治疗均取得一定进展[9]，但是晚期食管癌的疗效并不理想。早期诊断和早期治疗是提高其治疗效果的关键措施，因此寻找有效的新型生物标志物尤为重要。在食管癌中，越来越多的研究报道了lncRNA的关键调控作用[10-12]。人类有6个无远端同源盒（DLX）基因，包括3个双基因簇代表：DLX1/DLX2、DLX5/DLX6和DLX3/DLX4。其中，lncRNA DLX6-AS1是DLX6的反义RNA，属于DLX基因家族的一员，长度约为1 990 bp[13]。已有研究[14-16]表明，lncRNA DLX6-AS1在多种肿瘤中高表达，且可能作为致癌基因参与肿瘤的发生发展。如QIAN等[15]研究表明lncRNA DLX6-AS1在胃癌组织中过表达，且与肿瘤大小、淋巴结受累和TNM分期呈正相关；ZHU等[16]报道lncRNA DLX6-AS1在前列腺癌组织和细胞中均表达上调，且可能通过miR-497-5p/SNCG轴发挥致癌基因作用从而促进前列腺癌生长。而在食管癌的研究中，WANG等[7]发现lncRNA DLX6-AS1在食管鳞状细胞癌组织中高表达，且与肿瘤分化程度、远处转移和淋巴结转移等临床病理参数密切相关；敲除DLX6-AS1可明显抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并提高细胞凋亡率，同时还可影响细胞上皮间质转化过程。本研究在食管癌Eca-109细胞中检测也发现lncRNA DLX6-AS1表达上调，沉默其表达后细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显下降，与上述文献报道一致。说明lncRNA DLX6-AS1在食管癌中可能作为致癌基因发挥作用，但其具体作用机制尚不明确。

LncRNA可以作为一种竞争性内源性RNA与miRNA相互作用，进而参与靶基因的表达调控，并在肿瘤发生、侵袭及转移等恶性生物学行为中发挥重要作用。为了探索lncRNA DLX6-AS1的作用机制，本研究进一步通过DIANA-LncBase软件预测lncRNA DLX6-AS1的靶基因，结果发现lncRNA DLX6-AS1与miR-181b存在互补结合位点，双荧光素酶报告基因实验进一步验证了两者的靶向关系，且下调lncRNA DLX6-AS1可使miR-181b表达上调；在细胞功能实验中也发现上调miR-181b表达后Eca-109细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显下降，由此推测lncRNA DLX6-AS1可能通过靶向调控miR-181b表达促进细胞增殖、迁移和侵袭。既往研究已报道了miR-181b在多种肿瘤中的作用，如在胃癌细胞中miR-181b可通过靶向HK2抑制其糖酵解[17]；在多形性胶质母细胞瘤中通过抑制SP1介导的葡萄糖代谢抑制肿瘤生长[18]；在人动脉粥样硬化斑块和腹主动脉瘤中通过调节TIMP-3和弹性蛋白影响疾病进展[19]。但是miR-181b在Eca-109细胞中发挥作用的途径仍不清楚。本研究通过miRanda软件预测发现miR-181b与IL-6存在互补结合位点，且miR-181b可靶向负调控IL-6表达，与ZHANG等[8]报道结果一致。此外，本研究还发现IL-6在Eca-109细胞中高表达，上调其表达后细胞增殖、迁移及侵袭能力均显著提高，而同时上调miR-181b和IL-6表达后细胞增殖、迁移及侵袭能力均受到抑制。由此推测，lncRNA DLX6-AS1可能通过miR-181b靶向负调控IL-6而促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，lncRNA DLX6-AS1/miR-181b/IL-6通路在食管癌进展中发挥重要调控作用，lncRNA DLX6-AS1可能通过miR-181b靶向调控IL-6而促进食管癌细胞增殖、迁移及侵袭过程。本研究结果为进一步阐明食管癌的发生发展机制及其治疗研究提供了新思路。