H3K27M及其甲基化在弥漫性脊髓胶质瘤中的表达及与预后的关系

宫睿 刘暌 陈劲草 江普查

弥漫性脊髓胶质瘤是一种较为罕见的中枢神经系统肿瘤，预后较差，特别是高级别肿瘤（WHOⅢ～Ⅳ级）患者，5年生存率不超过20%[1-2]。近年来，虽然放化疗、靶向治疗及免疫治疗取得了长足进展，但是患者生存率仍未见明显提高[3-4]。因此，寻找胶质瘤的生物学标志物并开发潜在的治疗靶点有重要意义。既往研究发现可催化组蛋白H3第27位（histone H3 lysine27-to-methioninemutations，H3K27M）可以通过甲基化导致特定抑癌基因活性下降，并增强原癌基因活性，H3K27M及H3K27M三甲基化（H3K27me3）参与细胞周期调控，与肿瘤进展有关[5-6]。提示H3K27M及其甲基化在肿瘤中可能发挥重要作用，但其与弥漫性脊髓胶质瘤的关系尚未明确。为此，本研究分析H3K27M及H3K27me3与弥漫性脊髓胶质瘤预后的关系，以期为临床诊疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择武汉大学中南医院2016年1月—2019年1月收治的75例弥漫性脊髓胶质瘤患者为研究对象。纳入标准：⑴术前未接受放化疗；⑵组织病理活检确诊为弥漫性脊髓胶质瘤；⑶病例资料完整。排除标准：⑴合并患其他部位的原发性肿瘤者；⑵肝、肾、心等脏器功能不全者；⑶患自身免疫性疾病、血液系统疾病者。在75例患者中，男性41例，女性34例；平均年龄为（25.84±7.52）岁；WHO分级：Ⅱ级22例，Ⅲ级43例，Ⅳ级10例；平均肿瘤大小为（3.25±1.13）cm。本研究方案获武汉大学中南医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组化检测H3K27M表达水平

标本经10%中性福尔马林固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，4 μm连续切片。操作步骤严格按照免疫组化SP试剂盒（武汉卡诺斯科技有限公司）说明书进行H3K27M（1：1 000）染色。观察H3K27M在胶质瘤组织中的表达部位。免疫组化判定[7]：每张切片随机选择5个高倍视野（×200）评估，若经显微镜观察到细胞核、细胞浆内出现棕黄色细颗粒物，则提示阳性，按照染色强度以及阳性细胞占比进行计分。染色强度：无染色、淡黄、棕黄、棕褐色分别计0、1、2、3分。阳性细胞占比：0～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分别计1、2、3、4分，两项计分乘积即为最终结果，总分＞2分为阳性表达，≤2分为阴性表达。

1.3 染色质免疫沉淀联合芯片法检测H3K27me3表达水平

用TRIzol试剂（北京莱博润科生物科技有限公司）提取总RNA，测定RNA浓度与纯度，通过反转录试剂盒（武汉卡诺斯科技有限公司），逆转录成cDNA，依次加入Total RNA 2 μg，2.5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL，RTase Mix 1 μL，5×Reaction Buffer 5 μL，加入RNase/DNase Free Water使整体为25 μL，并行荧光定量聚合酶链式反应检测，反应条件：95℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃延伸、退火1 min，40个循环。上、下游引物序列分别为5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'、5'-GCTACTCAACTGAGGG-3'。采用2-△△Ct计算目的基因相对表水平。根据H3K27me3表达水平的平均值，将患者分为高表达组和低表达组。

1.4 随访

对所有患者进行门诊或电话随访，随访起始时间为2016年1月，每3个月随访1次，随访截至2021年1月，中位随访时间为22.5个月。记录患者的总生存期（overall survival，OS），OS定义为自确诊之日至患者死亡或最后一次随访的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。分类资料采用n（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法计算生存率，组间比较用log-rank检验。采用多因素Cox回归模型分析H3K27M、H3K27Mme3表达水平与OS的关联。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 弥漫性脊髓胶质瘤中H3K27M、H3K27me3的表达

弥漫性脊髓胶质瘤组织中H3K27M阳性表达率为65.33%（49/75），阴性表达率为34.67%（26/75）；弥漫性脊髓胶质瘤组织中H3K27me3平均表达量为0.54±0.22，以均值为界值将患者分为高、低表达两组，其中高表达率为58.67%（44/75），低表达率为41.33%（31/75）。见图1。

图1 H3K27M、H3K27me3在弥漫性脊髓胶质瘤中的表达Fig.1 Expression of H3K27M and H3K27me3 in diffuse spinal glioma

2.2 H3K27M、H3K27me3表达水平与患者临床病理特征的关系

H3K27M及H3K27me3表达水平均以WHO分级、颅内播散转移有关（均P＜0.05）；未发现H3K27M及H3K27me3表达水平与性别、年龄、肿瘤大小有关（均P＞0.05）。见表1。

表1 H3K27M、H3K27me3表达水平与患者临床病理特征的关系[n（%）]Tab.1 Relationship between H3K27M,H3K27me3 expression and pathological features[n(%)]

2.3 H3K27M、H3K27me3表达与OS的关联

生存分析结果显示，H3K27M阳性组2年生存率为51.6%，H3K27M阴性组为78.9%（log-rank χ2=7.954，P=0.005），见图2A。H3K27me3高表达组2年生存率为48.4%，H3K27me3低表达组为74.2%（log-rank χ2=8.130，P=0.004），见图2B。

进一步采用Cox回归分析H3K27M、H3K27me3表达与OS的关联，模型1校正年龄、性别后，显示H3K27M阳性表达组的死亡风险较H3K27M阴性表达组高 97%（HR=1.97，95%CI：1.35～2.87，P＜0.001），H3K27me3高表达组的死亡风险较H3K27me3低表达组高 71%（HR=1.71，95%CI：1.20～2.44，P=0.003）；进一步校正年龄、性别、WHO分期、颅内播散转移以及肿瘤大小后，结果显示H3K27M阳性表达组的死亡风险较H3K27M阴性表达组高67%（HR=1.67，95%CI：1.06～2.64，P=0.026），H3K27me3高表达组的死亡风险较 H3K27me3 低表达组高 84%（HR=1.84，95%CI：1.05～3.22，P=0.032），见表2。

表2 H3K27M、H3K27me3表达与OS关联的Cox回归分析结果Tab.2 Cox regression analysis results of H3K27M,H3K27me3 expression and OS

3 讨论

目前，随着基因遗传学、分子生物学等学科的发展，关于肿瘤发生与进展机制的研究越来越深入并取得了一定进展[8]。表观遗传学修饰与肿瘤发生发展密切相关，主要包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和甲基化等。有研究发现，组蛋白甲基化在基因表达调控中起重要作用，并且能够通过影响染色体结构“关闭”影响基因转录[9]。H3K27M蛋白属于组蛋白类型，有多种变体，分为5种亚基，包括H1、H2A、H2B、H3和H4。H3K27M是主要的甲基化修饰位点之一，H3K27M突变可引起H3K27低甲基化，影响基因转录稳定性，从而促进癌症的发生发展[9]。既往研究[10]表明H3K27M及其三甲基化与胃癌发生有关，FILBIN等[11]研究亦发现H3K27M参与了神经胶质瘤进展，但其作用机制未完全明确。本研究发现弥漫性脊髓胶质瘤组织中，H3K27M以阳性表达居多，H3K27me3以高表达居多。其机制可能与Zeste基因有关，研究认为Zeste基因增强子人类同源物2能调节肿瘤细胞的凋亡与增殖，参与肿瘤进展，可通过对H3K27M甲基化进行催化，对分化相关基因、肝细胞维持等功能予以介导，从而促使H3K27M及其甲基化参与肿瘤干细胞的分化、增殖过程[12]。研究表明H3K27M能对下游靶基因转录进行抑制，调节干细胞更新，促进细胞增殖，这可能是其促进肿瘤细胞增殖的机制之一[13-14]。H3K27M、H3K27me3在瘤体组织中的表达受Zeste基因增强子人类同源物2表达的调控，它能通过与组蛋白去乙酰基转移酶互相作用，促进H3K27M表达以及三甲基化，对肿瘤内抑癌基因表达进行抑制，损害自然杀伤细胞功能[15]。

本研究结果显示H3K27M阳性组、H3K27me3高表达组的Ⅲ～Ⅳ级患者、颅内播散转移率均较高，表明两者可能参与脊髓胶质瘤进展。本研究还发现H3K27M阳性表达，H3K27me3高表达均与较差的预后相关。值得注意的是，H3K27M酶活性改变能使癌细胞中H3K27M、H3K27me3表达异常，提升癌细胞转移能力，导致预后更差[16]。以上提示，H3K27M、H3K27me3可能是脊髓胶质瘤潜在的预后指标。

综上所述，弥漫性脊髓胶质瘤组织中H3K27M呈阳性表达，H3K27me3呈高表达，两者均与较差的预后相关。但本研究样本例数较少，且仅分析了2年的预后情况，未来还需增加样本量以及延长随访时间，分析H3K27M及其甲基化对远期预后的影响。