阿帕替尼对胃癌HGC-27细胞放射敏感性的影响及其作用机制

蒋健 左云 倪晨 朱惠平

在我国，胃癌发病率和死亡率分别位于所有恶肿瘤的第2位和第3位[1-2]。因我国胃癌的早期筛查普及率仍较低，目前临床上多数患者就诊时已处于中晚期，治疗方式主要有姑息手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及不同治疗手段联合。放疗常作为胃癌根治术后的辅助及姑息治疗手段，INT0116研究[3]已证实可切除胃癌术后同步放化疗可以提高5年生存率并降低复发率，这也为胃癌的术后辅助放化疗奠定了基础。但是在治疗过程中，肿瘤对放疗耐受和抵抗成为制约患者预后的关键。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是多种实体肿瘤调节血管形成最重要的信号分子。既往研究显示，放疗与抗血管生成类药物联用可抑制肿瘤细胞增殖[4]。阿帕替尼是一种口服的血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的小分子酪氨酸激酶抑制剂，主要用于晚期胃癌的治疗。本研究通过体外实验探讨阿帕替尼对胃癌细胞的放射增敏作用，以期为晚期胃癌的综合治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及仪器

胃癌细胞HGC-27购自中科院上海细胞库。阿帕替尼（纯度：98%）、CCK-8试剂盒购自上海碧云天公司，RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自以色列BI公司，胰酶购自美国Gibco公司，人VEGF酶联免疫吸附法试剂盒（ELISA KIT）购自武汉华美公司，兔抗人磷酸化组蛋白H2AX抗体、羊抗兔IgG购自英国Abcam公司，细胞周期试剂盒购自江苏凯基公司，AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒、流式细胞仪购自美国BD公司，正置荧光显微镜购自德国Leica公司，直线加速器购自美国瓦里安公司。

1.2 细胞培养及照射方法

HGC-27细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞进行后续实验。

将处理好的细胞培养皿置于1.5 cm厚有机玻璃板上，以6 MV-X射线对细胞进行垂直照射，源皮距为100 cm，框架角度为180°，剂量率为450 cGy/min。

1.3 ELISA法检测HGC-27细胞中VEGF的表达

取对数生长期HGC-27细胞接种于10 cm培养皿中，分别给予不同剂量（2 Gy、4 Gy、6 Gy、10 Gy、20 Gy）照射后，继续培养18 h、24 h、48 h，取各组细胞上清液；对照组细胞不做处理（0 Gy）。然后将各组上清液分别加入包被有VEGF抗体的酶标板中，按照ELISA试剂盒检测方法进行操作，并根据各样本的吸光度（A）值，分别计算出各组细胞VEGF的分泌量。实验独立重复3次。

1.4 CCK-8检测HGC-27细胞的增殖能力

1.4.1 不同浓度阿帕替尼对HGC-27细胞增殖能力的影响 实验分为空白组、对照组和药物组。取对数生长期的HGC-27细胞，用胰酶消化后制成浓度为5×103/μL细胞悬液，对照组和药物组分别取100 μL细胞悬液接种于96孔板中，空白组仅加入100 μL RPMI-1640培养基，待细胞贴壁后，药物组更换为预先用RPMI-1640培养基配置的不同浓度（5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L）阿帕替尼溶液。各组细胞分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培养箱中孵育2 h。用酶标仪测定450 nm处的A值，并根据A值计算各组细胞的增殖抑制率，以及不同时间点的50%细胞生长抑制浓度（IC50）。细胞增殖抑制率（%）=[1-（药物组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）]×100%。实验独立重复3次。

1.4.2 阿帕替尼联合不同剂量照射对HGC-27细胞增殖能力的影响 实验分为空白组、对照组、单照组（2 Gy、6 Gy照射）和联合组（10 μmol/L阿帕替尼分别联合2 Gy、6 Gy照射）。取对数生长期的HGC-27细胞并制成细胞悬液，空白组仅加入100 μL培养基，其他组按2×104/孔的细胞浓度接种于96孔板中；待细胞贴壁后更换溶液，空白组、对照组和单照组细胞分别添加RPMI-1640培养基常规培养，联合组细胞添加10 μmol/L的阿帕替尼培养。24 h后，单照组和联合组分别置于2 Gy和6 Gy的X线下照射，继续培养24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育2 h。用酶标仪测定450 nm处的A值。相对细胞活性（%）=[（单照组或联合组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）]×100%。实验独立重复3次。

1.5 流式细胞仪检测HGC-27细胞的凋亡能力和细胞周期

实验分为对照组、单照组（2 Gy、6 Gy照射）和联合组（10μmol/L阿帕替尼分别联合2 Gy、6 Gy照射）。取对数生长期的HGC-27细胞制成细胞悬液，按5×105/孔的密度接种于6孔板中。待细胞贴壁后更换溶液，对照组和单照组细胞中加入RPMI-1640培养基常规培养，联合组细胞中加入10 μmol/L阿帕替尼培养；24 h后，单照组和联合组分别置于2 Gy和6 Gy的X线下照射，继续培养24 h。各组细胞用胰酶消化、PBS冲洗后，各取部分细胞分别用PBS重悬为1×106/mL的单细胞悬液，然后根据FITC Annexin V/PI双染法试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；各组另一部分细胞分别用PBS重悬为1×106/mL的单细胞悬液后，加入75%冰乙醇并置于-20℃冰箱中固定过夜，再根据PI单染法试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪检测细胞周期。实验独立重复3次。

1.6 免疫荧光染色技术检测HGC-27细胞中γ-H2AX的表达

实验分为对照组、6 Gy单照组和6 Gy联合组（10 μmol/L阿帕替尼联合6 Gy照射）。3组细胞的处理措施同方法1.5。6 Gy单照组和6 Gy联合组细胞均在6 Gy的X线下照射，并分别于照射1 h、24 h时收集细胞。用PBS漂洗细胞3次后，加入预冷的4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次；用0.5% Triton-100通透孵育10 min，PBS漂洗3次；滴加免疫荧光染色专用封闭液，封闭15 min，加入γ-H2AX抗体（一抗），4℃下孵育过夜；用PBS洗涤，滴加羊抗兔IgG（荧光二抗），再用PBS漂洗3次；用含DAPI抗荧光淬灭封片剂封片，在正置荧光显微镜下观察核内焦点情况。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量数据均采用均数±标准差（）表示，多个样本均数间比较采用单因素方差分析，后续两两比较采用LSD-t检验。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度阿帕替尼对胃癌HGC-27细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示，不同浓度（5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L）阿帕替尼对HGC-27细胞均有增殖抑制作用，且与5 μmol/L组相比，其余浓度组随着阿帕替尼药物浓度增加及作用时间延长，相应的细胞增殖抑制率逐渐增强（均P＜0.05），见表1。阿帕替尼作用24 h、48 h和72 h的IC50分别为14.12 μmol/L、11.32 μmol/L和8.69 μmol/L，为保证一定量的存活细胞，本研究选择10 μmol/L作为后续实验用药浓度，观察时间点选取24 h。

表1 不同浓度阿帕替尼对HGC-27细胞增殖的影响（±s）Tab.1 Effect of different concentration Apatinib on the proliferation of HGC-27 cells(±s)

表1 不同浓度阿帕替尼对HGC-27细胞增殖的影响（±s）Tab.1 Effect of different concentration Apatinib on the proliferation of HGC-27 cells(±s)

aP＜0.05,compared with 5 μmol/L;bP＜0.05,compared with 10 μmol/L;cP＜0.05,compared with 15 μmol/L

Apatinib(μmol/L)0 5 1 0 15 20 n 3 3 3 3 3 Inhibition rate(%)24 h 0 12.58±2.72 23.21±3.83 53.07±3.88ab 73.20±11.27abc 48 h 0 16.55±7.24 35.28±8.44a 63.60±6.38ab 85.54±6.77abc 72 h 0 25.75±3.55 51.23±8.67a 77.29±7.29ab 89.73±9.43abc

2.2 不同照射剂量对HGC-27细胞VEGF表达的影响

ELISA实验结果显示，与对照组相比，不同剂量（2 Gy、4 Gy、6 Gy、10 Gy和20 Gy）分别照射18 h、24 h和48 h后HGC-27细胞中的VEGF分泌量均显著增加，且随着照射剂量升高和照射时间延长，VEGF分泌越明显（均P＜0.01），见图1。各时间点曲线中，VEGF的表达均在10 Gy时上升最明显，然后逐渐趋于平稳，故选择2 Gy和6 Gy进行后续实验。

图1 不同照射剂量下HGC-27细胞的VEGF表达水平Fig.1 Expression level of VEGF in HGC-27 cells under different doses of irradiation

2.3 阿帕替尼联合不同剂量照射对HGC-27细胞增殖能力的影响

CCK-8检测结果显示，与对照组相比，2 Gy单照组、2 Gy联合组、6 Gy单照组和6 Gy联合组的细胞增殖率分别为95.67%±1.53%、62.00%±3.00%、88.67%±2.08%、43.00%±3.06%，其中6 Gy单照组的细胞增殖率低于2 Gy单照组（t=3.431，P=0.009）；2 Gy联合组和6 Gy联合组的细胞增殖率均低于相应单照组（t=16.495，22.538，均P＜0.001），且 6 Gy联合组的增殖率低于2 Gy联合组（t=25.968，P＜0.001）。表明不同剂量照射均可降低细胞增殖能力，阿帕替尼能增强放射线对细胞增殖的抑制作用。

图2 阿帕替尼对不同剂量照射下HGC-27细胞增殖的影响（±s）Fig.2 Effect of Apatinib on the proliferation of HGC-27 cells under different doses of irradiation

2.4 阿帕替尼联合不同剂量照射对HGC-27细胞凋亡和周期的影响

流式细胞仪检测结果显示，对照组、2 Gy单照组、2 Gy联合组、6 Gy单照组和6 Gy联合组细胞的凋亡率分别为1.20%±0.26%、4.40%±0.80%、14.80%±1.15%、7.20%±1.14%、20.10%±1.25%，G2/M期细胞比例分别为10.50%±0.82%、15.10%±1.54%、33.00%±1.59%、22.90%±2.17%、40.70%±1.37%，其中单照组及联合组的细胞凋亡率均明显高于对照组（均P＜0.01），联合组细胞凋亡率高于相应单照组（均P＜0.001），且6 Gy联合组的细胞凋亡率高于2 Gy联合组（P＜0.001），见图3；联合组滞留于G2/M期的细胞比例明显高于单照组（均P＜0.001），且6 Gy联合组的G2/M期细胞比例高于2 Gy联合组（P＜0.001），见图4。以上实验结果表明阿帕替尼能够增强照射导致的细胞凋亡并促使照射后的细胞更多的停滞于G2/M期，且高剂量联合组细胞的凋亡率和G2/M期细胞比例更高。

图3 阿帕替尼对不同剂量照射下HGC-27细胞凋亡的影响（±s）Fig.3 Effect of Apatinib on apoptosis of HGC-27 cells under different doses of irradiation

图4 阿帕替尼对不同剂量照射下HGC-27细胞周期的影响（±s）Fig.4 Effect of Apatinib on HGC-27 cell cycle under different doses of irradiation

2.5 阿帕替尼联合不同剂量照射对HGC-27细胞中γ-H2AX表达的影响

免疫荧光染色技术检测结果显示，照射1 h后，6 Gy单照组和6 Gy联合组细胞均可见γ-H2AX核内焦点出现，随后6 Gy单照组的核内焦点逐渐减少且在24 h后达到照射前水平，而6 Gy联合组的核内焦点淬灭延迟，24 h后仍未恢复到照射前水平。说明阿帕替尼可干扰照射诱导的DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）修复。

图5 阿帕替尼联合照射对HGC-27细胞中γ-H2AX表达的影响（×200）Fig.5 Effect of Apatinib combined with radiation on expression of γ-H2AX in HGC-27 cells(×200)

3 讨论

放疗是胃癌综合治疗的重要组成部分，但是大多数实体肿瘤中存在一定比例的乏氧细胞，这部分细胞因对射线有抗拒作用而限制了放疗效果，因此选择合适的放疗增敏剂尤为重要。多项国内外临床研究结果显示放疗联合化疗在局部进展期、转移性晚期胃癌中对比单纯化疗能明显减少局部复发并延长生存期[5-6]。胃癌放疗的剂量及分割方式目前尚无明确的标准，综合多项研究结果，发现分次1.8～2.0 Gy/d，每周5次，总剂量50～60Gy的常规分割方式与单次3～8 Gy，总剂量30～40 Gy的大分割方式或立体定向放疗均能带来显著的疗效，且患者均可耐受[7-9]。研究表明，辐射可诱导VEGF表达增加并激活其受体VEGFR，然后正向调控肿瘤血管生成，且VEGFR-2较VEGFR-1和VEGFR-3能更显著增强激酶活性，促使肿瘤细胞增殖，并通过多种途径导致放射敏感性下降[10]。FLICKINGER等[11]用不同剂量（0～10 Gy）单次照射犬黑色素瘤细胞系，结果显示VEGF浓度呈剂量依赖性增加，且在8 Gy和10 Gy时最明显，但VEGFR-2的表达随剂量升高而下调。在食管癌、非小细胞肺癌、脑胶质瘤、肝癌等肿瘤中发现，高选择性VEGFR-2抑制剂阿帕替尼可有效增强其放射敏感性[12-15]。本研究选取 2 Gy、4 Gy、6 Gy、10 Gy、20 Gy等剂量X线对胃癌细胞进行单次照射，发现单次大剂量照射（＞2 Gy）较2 Gy左右的常规分割方式更能促进VEGF表达，且在10 Gy时上升最为明显，进一步证实辐射可增强VEGF表达，进而促进肿瘤血管生成，降低放疗敏感性。进一步选取10 μmol/L阿帕替尼联合不同剂量（2 Gy、6 Gy）照射HGC-27细胞，结果亦发现联合组对细胞增殖的抑制作用较单照组明显增强，细胞凋亡率及G2/M期的细胞比例均高于对照组及单照组，且高剂量联合组表现出更强的作用，说明阿帕替尼具有良好的增敏作用，联合放疗可以进一步抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，且高剂量辐射可能与阿帕替尼有更好的协同作用。

电离辐射可诱导真核生物中的DSBs，当DSBs形成细胞即可启动损伤修复机制。γ-H2AX是细胞DNA损伤断裂后形成的磷酸化染色质核小体组蛋白，是电离辐射诱导DNA-DSB的敏感标志物，与DSB修复能力相关，通常修复缺陷的细胞对放疗表现出更高的敏感性[16-17]。在肝癌细胞研究中，LIAO等[15]发现阿帕替尼可降低细胞DNA损伤修复活性，无论是单照组还是放疗联合阿帕替尼组，几乎所有肝癌细胞均在照射1 h后出现γ-H2AX焦点，24 h后联合组的γ-H2AX焦点明显增多。γ-H2AX识别抗体免疫荧光法是检测电离辐射致DNA双链断裂的一项技术，可利用免疫荧光标记技术，以激光共聚焦显微镜为硬件设备，通过检测γ-H2AX的量反映细胞的DSBs情况。本研究对γ-H2AX进行荧光标记亦观察到放疗1 h后胃癌细胞核内γ-H2AX焦点形成，24 h后核内焦点逐渐减少，且联合组中γ-H2AX焦点淬灭明显较单照组延迟，说明阿帕替尼可能通过干扰辐射诱导的DSBs修复，从而增强胃癌细胞的放疗敏感性。

综上所述，阿帕替尼可增强胃癌HGC-27细胞的放射敏感性，联合放疗可增强HGC-27细胞的增殖抑制能力和细胞凋亡能力，同时促使细胞阻滞于G2/M期，其作用机制可能是通过调控γ-H2AX表达而影响DNA双链修复实现，这一结果为改善胃癌的放疗疗效提供了新的策略。