锦灯笼醇提取物通过lncRNA AK093987基因的表达对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响及机制研究

黄余峰 于立江 崔丽华 陈静 孙长春 侯娟 吴志伟 王钊 杨曦

结肠癌是最致命的癌症之一，也是最常见的饮食相关癌症[1,2]。目前，结肠癌可通过结肠切除、化学疗法、靶向疗法、激素疗法和免疫疗法治疗[3]。但这些策略仍无法满足临床需求，包括延长患者生存期，预防癌症转移和降低复发率[4]。为提高结肠癌患者存活率和改善治疗效果，需要开发和评估具有抗癌特性的新药物。锦灯笼(calyx seu fructus physalis)是茄科植物酸浆的干燥宿萼或带果实的宿萼，迄今为止，锦灯笼提取物被证明通过增殖抑制和凋亡促进来发挥对肝癌[5]、肺癌[6]的抗癌活性。然而锦灯笼对结肠癌是否存在抗肿瘤作用，目前仍不清楚。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)可以调节细胞行为，包括结肠癌[7]。既往资料表明，lncRNA AK093987在结肠癌中高表达，下调其表达不利于结肠癌细胞LoVo的增殖[8]。但lncRNA AK093987在锦灯笼调节结肠癌进展中的作用仍然未知。因此，本研究探讨锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响，并通过其对结肠癌细胞中lncRNA AK093987的调控作用，旨在阐明锦灯笼醇提取物的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 结肠癌细胞HT29获自武汉Procell公司，将其置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并于37℃、5% CO2、饱和湿润的环境中培养。

1.2 试剂 细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)、Annexin V-FITC试剂盒、RIPA裂解物(美国Sigma-Aldrich)，TRIzol试剂(美国Thermo Fisher)，PrimeScript RT试剂盒、SYBER Green master mix试剂盒、si-lncRNA AK093987、si-NC、pcDNA-lncRNA AK093987、pcDNA-NC(大连TaKaRa)。锦灯笼药材(干燥宿萼)粉碎过40目筛后，以1∶20的料液比加入80%乙醇，浸泡12 h后进行回流提取，时间2 h，重复2次。将2次回流提取的滤液合并，通过旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏，干燥后即得锦灯笼醇提取物[9]，得率约为29.52%。实验时，将锦灯笼醇提取物用培养基稀释为2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml的浓度备用。

1.3 实验分组与处理 结肠癌细胞HT29分为NC组：正常培养，对照；低剂量组：2.5 μg/ml锦灯笼醇提取物作用48 h；中剂量组：5 μg/ml锦灯笼醇提取物作用48 h；高剂量组：10 μg/ml锦灯笼醇提取物作用48 h；si-NC组：转染si-NC 48 h；si-lncRNA AK093987组：转染si-lncRNA AK093987 48 h；高剂量+pcDNA-NC组：10 μg/ml锦灯笼醇提取物+转染pcDNA-NC；高剂量+pcDNA-lncRNA AK093987组：10 μg/ml锦灯笼醇提取物+转染pcDNA-lncRNA AK093987。细胞转染时，遵循Lipofectamine 2000试剂的说明步骤，分别转染si-NC、si-lncRNA AK093987、pcDNA-NC、pcDNA-lncRNA AK093987。其中，pcDNA-NC和pcDNA-lncRNA AK093987转染6 h后，用含10 μg/ml锦灯笼醇提取物的培养基替换转染培养基，继续培养48 h。每组设9孔。

1.4 Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase-3)表达 结肠癌细胞HT29用RIPA裂解物提取总蛋白。接下来，将蛋白在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上于100 V分离1.8 h。将蛋白进一步转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%脱脂牛奶封闭1 h。将CyclinD1抗体(1∶1 000)、Cleaved-caspase-3抗体(1∶1 000)和β-肌动蛋白(β-actin)抗体(1∶1 000；对照)在4℃下与膜孵育过夜。此外，用0.1% Tween-PBS清洗膜后，用二抗(1∶10 000)探测蛋白，并用ECL显影。

1.5 CCK-8检测细胞增殖能力 细胞处理48 h后，按照CCK-8试剂说明书的指示，对96孔板中2×104个结肠癌细胞HT29进行CCK-8反应。反应1 h后，在Multiskan酶标仪上读取各组450 nm的吸光度A值。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集结肠癌细胞HT29，以1 000 r/min的速度在4℃下离心4 min，并调整为1×106个细胞/ml。然后将HT29细胞在1 ml冷PBS中洗涤2次，加入200 μl结合缓冲液。用10 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)在室温下处理细胞15 min，然后加入300 μl结合缓冲液，立即通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测lncRNA AK093987表达 使用TRIzol提取结肠癌细胞HT29总RNA，通过NanoDrop 2000c分光光度计检查总RNA的质量和数量。cDNA的合成通过PrimeScript RT试剂盒进行，将正向引物、反向引物、cDNA模板、双蒸水与SYBER Green master mix等混合在一起进行扩增反应。lncRNA AK093987的表达水平被标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)，并使用2-ΔΔCt法计算。lncRNA AK093987与GAPDH引物由上海生工公司合成，参照Tang等[7]的报道。每个独立实验均重复3次。

2 结果

2.1 不同浓度锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29增殖的影响 与NC组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组锦灯笼醇提取物减少结肠癌细胞HT29中CyclinD1蛋白的表达水平，降低细胞增殖能力，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

表1 不同浓度锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29增殖的影响

图1 Western blot检测CyclinD1蛋白的表达

2.2 锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29凋亡的影响 与NC组比较，低剂量组、中剂量组和高剂量组锦灯笼醇提取物增加结肠癌细胞HT29的凋亡率，提高Cleaved-caspase-3蛋白表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表2。

图2 锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29凋亡的影响;A Western blot检测Cleaved-caspase-3蛋白的表达;B 流式细胞仪检测细胞凋亡

表2 锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29凋亡的影响

2.3 锦灯笼醇提取物对lncRNA AK093987表达的影响 低剂量组、中剂量组和高剂量组锦灯笼醇提取物作用后，结肠癌细胞HT29内lncRNA AK093987的表达水平均低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 锦灯笼醇提取物对lncRNA AK093987表达的影响

2.4 si-lncRNA AK093987对结肠癌细胞HT29增殖、凋亡的影响 si-lncRNA AK093987组结肠癌细胞HT29中lncRNA AK093987、CyclinD1蛋白的表达水平和增殖能力低于si-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平和凋亡率高于si-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图3。

表4 si-lncRNA AK093987对结肠癌细胞HT29增殖、凋亡的影响

图3 Western blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.5 lncRNA AK093987可以逆转锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29增殖和凋亡的影响 高剂量+pcDNA-lncRNA AK093987组结肠癌细胞HT29中lncRNA AK093987、CyclinD1蛋白的表达水平和增殖能力高于高剂量+pcDNA-NC组，Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平和凋亡率低于高剂量+pcDNA-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4，表5。

图4 Western Blot检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表5 lncRNA AK093987可以逆转锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29增殖和凋亡的影响

3 讨论

近年来，越来越多的中药被临床用于癌症的辅助治疗。锦灯笼作为一种药用价值广泛的中药，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化[10,11]、抗微生物和利尿[12]等活性。关于锦灯笼抗肿瘤机制的研究大多数集中在诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖方面，例如锦灯笼醇提取物以时间和剂量依赖方式减弱肝癌细胞SMMC-7721的增殖[5]，锦灯笼水提物以浓度依赖方式降低肺癌SPC-A-1细胞的增殖能力，并以浓度依赖方式加速其凋亡[6]。这充分揭示了锦灯笼在细胞生长过程中的潜在作用和抗肿瘤活性。

致癌作用与细胞触发凋亡能力的逐步降低有关，凋亡是重要的肿瘤抑制机制，也是癌症发展的重要障碍[13,14]。因此本研究探讨锦灯笼醇提取物在结肠癌细胞增殖和凋亡中的作用，结果表明，锦灯笼醇提取物在2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml的浓度下，均可抑制结肠癌细胞HT29的增殖能力，并且诱导凋亡，这与前述报道相近。另外，CyclinD1是公认的肿瘤启动子[15]，caspase-3的活化对刺激细胞凋亡至关重要[16]。本研究中，2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29中CyclinD1的下调和对Cleaved-caspase-3的上调也证明了其抗增殖和促凋亡的能力。这些结果提供了新的证据，提示锦灯笼醇提取物具有一定的抗结肠癌潜力。

lncRNA在癌症进展中的作用早已得到研究[17]。lncRNA AK093987被认为是肿瘤诊断和治疗的候选生物标志之一。此前，Tang等[7]揭示了lncRNA AK093987在结肠癌中高表达，下调lncRNA AK093987使结肠癌细胞LoVo增殖受到抑制。此外，lncRNA AK093987在胃癌[18]与弥漫大B细胞淋巴瘤[19]中同样高表达，能够加速肿瘤细胞的恶性转化，是结肠癌、胃癌和弥漫大B细胞淋巴瘤重要的预后因素。但除了这几项报告，目前笔者发现仍然缺乏关于lncRNA AK093987的其他资料。

本研究观察到，结肠癌细胞HT29中lncRNA AK093987被锦灯笼醇提取物显著下调。转染si-lncRNA AK093987后，结肠癌细胞HT29的增殖和CyclinD1表达显著减弱，Cleaved-caspase-3表达和凋亡率显著增强，与前人研究[7,18,19]吻合，提示lncRNA AK093987是结肠癌的致癌因子。根据报道，lncRNA与一些药物的抗肿瘤机制有关，例如lincRNA-p21通过稳定结肠癌中的钙黏附蛋白来介导银杏叶提取物EGb 761的抗癌作用[20]。为进一步考察lncRNA AK093987是否涉及锦灯笼醇提取物对结肠癌的潜在调节机制，本研究转染pcDNA-lncRNA AK093987以过表达lncRNA AK093987，发现锦灯笼醇提取物对结肠癌细胞HT29增殖、凋亡、CyclinD1和Cleaved-caspase-3表达的影响被过表达lncRNA AK093987所逆转。综合这些结果，锦灯笼醇提取物发挥抗结肠癌的作用可能是通过下调lncRNA AK093987表达来实现的。

综上所述，锦灯笼醇提取物对结肠癌显示出抗肿瘤活性，可能通过下调结肠癌细胞中lncRNA AK093987的表达来抑制细胞增殖，并诱导其凋亡。这些结果可能为锦灯笼在结肠癌治疗中的潜在用途提供新的线索。