多房棘球蚴欧洲株与中国宁夏株在蒙古沙鼠肝组织内发育及病理损伤的比较

孙悦翔 ， 张春霞 ， 谢楷东 ， 唐志强 ， 李 静 ， 张浩吉 ， 黄福强

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院 ， 广东 佛山 528225 ； 2.青海农牧科技职业学院 ， 青海 湟源 812100)

多房棘球蚴又称泡球蚴，为多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)中绦期幼虫，主要分布在北半球[1]，在我国主要分布在西部和北部广大农牧地区，即新疆维吾尔自治区、青海、甘肃、宁夏回族自治区、西藏自治区、内蒙古自治区和四川等地[2]。

多房棘球绦虫成虫长1.2～4.5 mm，形态与细粒棘球绦虫相似，但两者生殖孔开口位置有所不同，细粒棘球绦虫生殖孔开口于侧缘中部偏后，多房棘球绦虫则开口于侧缘的前半部[3]。多房棘球蚴为圆形或卵圆形的囊泡团块，大小由豌豆到核桃大，囊泡团块一般由许多大小为0.1～0.7 cm的小囊聚集而成[4-5]。多房棘球蚴病是一种极为重要的人兽共患寄生虫病，其病原体主要寄生于小型啮齿类(如田鼠、沙鼠等)动物的肝脏，人因误食犬排出的虫卵或被虫卵污染的食物而偶有感染[4]。

多房棘球蚴的生长特点是弥漫性浸润，压迫周围组织，引起器官萎缩和功能障碍。多房棘球蚴病如同恶性肿瘤一般，还可能转移到全身各个器官中[5]，俗称“虫癌”，再加上它是一种自然疫源性疾病，所以预防与治疗都非常困难。本试验利用不同地理株多房棘球蚴感染蒙古沙鼠，分离肝脏和包囊组织制作组织切片并进行病理组织学观察，为多房棘球蚴病的病理组织学诊断提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 感染中国宁夏株多房棘球蚴的蒙古沙鼠3只，感染欧洲株多房棘球蚴的蒙古沙鼠3只，空白对照组蒙古沙鼠3只，本试验用蒙古沙鼠为实验室自繁自养。

1.2 寄生虫 由佛山科学技术学院动物寄生虫实验室蒙古沙鼠传代保存的中国宁夏株棘球蚴和欧洲株棘球蚴。

1.3 主要仪器设备 净化工作台(SW-CJ-2F)，生物组织包埋机(KD-BM)，电脑生物组织摊、烤片机(KD-T)，石蜡切片机(HM315R)，电热恒温干燥箱(GZX-DH.500BS)，徕卡生物显微镜(DM3000)，电热恒温培养箱(HDPF-55)。

1.4 主要试剂 各浓度乙醇，二甲苯，石蜡，苏木精，稀碳酸锂水溶液，伊红溶液等。

1.5 试验方法

1.5.1 试验分组及处理 参照Spiliotis等[6]和章宁等[7]的方法，将2株虫株于同一天分别腹腔接种同日龄蒙古沙鼠。试验组(宁夏株感染组和欧洲株感染组)蒙古沙鼠注射0.5 mL包囊团块悬液，空白对照组蒙古沙鼠注射0.5 mL PBS缓冲液，沙鼠自由采食，每周固定2次更换垫料、饲料和饮水。接种2个月后对试验组和空白对照组蒙古沙鼠进行安乐死，剖检并摘取蒙古沙鼠肝脏，生理盐水清洗3次，然后用福尔马林固定48 h后常规脱水，经石蜡包埋，切片备用。对于取样后的蒙古沙鼠及剩余的包囊团块进行无害化处理。

1.5.2 苏木精-伊红(H.E.)染色 将试验组和空白对照组蒙古沙鼠肝脏切片放入烤箱中60 ℃烘烤45 min后常规脱蜡、水化，根据参考文献[8]的步骤进行染色：(1)苏木精染液浸泡5 min；(2)自来水冲洗2 min；(3)1%盐酸-酒精分化2 s或直至显微镜下看到切片呈红色；(4)自来水冲洗45 s；(5)稀碳酸锂水溶液蓝化30 s；(6)自来水冲洗2 min；(7)80%酒精浸泡5 min；(8)伊红染色10～20 s。染色完毕后，再将组织切片经行常规脱水、透明和封片。

1.5.3 病理组织观察 将制作好的试验组和空白对照组切片放置在显微镜(DM3000)下观察并进行比较分析。

2 结果

2.1 感染模型的建立 建立多房棘球蚴蒙古沙鼠感染动物模型时，宁夏株和欧洲株多房棘球蚴包囊液注射到蒙古沙鼠腹腔后，所注射的蒙古沙鼠在感染2个月后均出现身体消瘦、腹部肿大等临床症状，经断颈法处死并剖检后发现，所有注射过欧洲株和宁夏株棘球蚴包囊液的蒙古沙鼠腹腔内均出现大量直径0.3～2.0 cm的不规则、圆形、白色、半透明或不透明包囊，且多与肝脏、肠道粘连并浸润肝脏造成其严重萎缩，其他器官均有由包囊产生的不同程度的压迫。结果表明宁夏株和欧洲株多房棘球蚴均对蒙古沙鼠易感。

2.2 肝脏组织病理学观察 通过不同倍数显微镜的观察结果如图1～3所示，放大50倍时，试验组与空白对照组相比，肝脏新生血管明显增多，且宁夏株感染组蒙古沙鼠的新生血管增多更明显；放大100倍时，试验组肝组织结构破坏较明显，窦间隙增宽，且欧洲株感染组肝组织破坏更为严重，空白对照组蒙古沙鼠肝组织结构基本正常；放大400倍时，试验组肝细胞变性肿胀明显，胞核淡染、膨胀，而空白对照组肝细胞胞核染色清晰。同时观察还发现，宁夏株感染组和空白对照组肝细胞胞间均有少量红细胞浸润。

图2 蒙古沙鼠肝脏组织病理学观察(H.E.染色，100×)

图3 蒙古沙鼠肝脏组织病理学观察(H.E.染色，400×)

2.3 不同地理株多房棘球蚴在蒙古沙鼠肝脏中的发育情况比较 结果如图4所示，感染欧洲株多房棘球蚴的肝脏组织中可发现多房棘球蚴生发层结构清晰，生发层周围细胞增生，部分生发层细胞脱落，且生发层外围堆积有纤维样物质的角皮层，但所观察视野部分无原头蚴；感染宁夏株多房棘球蚴的肝脏组织中同样发现有清晰的生发层结构和纤维样的角质层，在囊壁周围发现有育囊及大量的原头蚴。

图4 多房棘球蚴在蒙古沙鼠肝脏中发育情况(H.E.染色)

3 讨论

本试验结果显示，不论是注射了欧洲株还是宁夏株多房棘球蚴的蒙古沙鼠，在饲养2个月后，蒙古沙鼠体腔中均会出现多房棘球蚴的生长和增殖，生成大量结节样包囊团块(内含微小囊)，这些包囊团块能不断生长，侵入肝脏并长期性的侵占、压迫肝脏，使肝脏发生变性并逐渐萎缩。已有研究证实，蒙古沙鼠是多房棘球蚴感染的理想模型且多数实验室均用蒙古沙鼠对不同地方分离的多房棘球蚴虫株进行实验室的感染和传代[6]。

在对比欧洲株和宁夏株多房棘球蚴时发现，两者均可以对蒙古沙鼠肝脏产生相似的寄生虫性病理损伤，主要表现为2株不同地理株多房棘球蚴寄生后宿主的肝脏都伴随着新生血管的生成。这些新生的血管是肝脏受多房棘球蚴浸润性生长的病理性反应，为寄生虫的生长提供所需营养物质。同时，由于肝脏会受寄生虫的压迫和刺激，肝组织结构也开始慢慢变性，肝细胞正常的整齐排列状态也开始慢慢瓦解，肝窦间隙增宽，肝细胞在多房棘球蚴寄生的环境下，开始病理性变性，最终导致细胞核状态发生变化，在H.E.染色中显示为细胞核淡染。本试验观察到感染棘球蚴的蒙古沙鼠肝脏组织学变化情况与周青等[9]及imeková等[10]对小鼠肝脏多房棘球蚴中血管新生与病程发展的相关性研究结果及论述相符。

虽然欧洲株和宁夏株多房棘球蚴均能引起肝组织的损伤和肝脏新生血管的生成，但通过比较发现，感染欧洲株多房棘球蚴蒙古沙鼠肝组织结构破坏程度和窦间隙增宽宽度均大于宁夏株，感染宁夏株棘球蚴蒙古沙鼠新生血管要多于欧洲株。说明欧洲株棘球蚴在一定时期内对宿主肝脏损害程度要大于宁夏株，且宁夏株在一定的发育阶段对宿主的营养需求可能高于欧洲株棘球蚴。在对肝脏组织病理损伤观察的同时，本试验也对侵染肝脏组织的欧洲株和宁夏株棘球蚴的发育状况进行了观察，发现感染宁夏株蒙古沙鼠肝脏中的棘球蚴生发层组织内含大量原头蚴，但欧洲株未观察到，提示2株不同地理株多房棘球蚴在腹腔感染模型中的发育速度和原头蚴增殖能力不同，且欧洲株感染宿主后包囊团块大多是由微小囊与宿主组织结合形成，而宁夏株的包囊团块是由大量含原头蚴的育囊附着于生发层以及囊内游离于囊液的微小囊或原头蚴相结合然后再与宿主组织结合形成。

本试验在操作过程中蒙古沙鼠处死方式是采用断颈法，其中空白对照组蒙古沙鼠肝脏切片中也同样发现有不同程度的红细胞游离出血管，浸润至肝脏组织周围，出现这一现象的原因很可能是蒙古沙鼠断颈时应激反应较大，导致血管扩张破裂，红细胞游离。同时，在空白对照组肝脏细胞也出现微小的肝细胞排列不紧密，可能是在组织包埋中，蜡块融化的温度过高导致。对于以上这些因素的影响还需做进一步的研究。

虽然目前从基因水平来说对多房棘球蚴的分类还不支持多房棘球绦虫有不同的种或亚种，且多房棘球蚴各地方分离株线粒体基因差异较小[11]，但通过本试验发现，不同地理株的多房棘球蚴在一定时期内对肝脏组织的损伤程度、发育速度以及原头蚴的增殖能力会存在一定程度的差异。