新疆北疆部分地区牛羊包虫病流行病学调查与cox1和nad1基因分析

热衣汗·玉素甫 贾万忠 闫鸿斌 吴耀东 吴燕涛 高佳敏李莲瑞 石长青*

（1塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730000）

细粒棘球蚴病（Echinococcosis）又称包虫病，是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granuloses）的中绦期幼虫—细粒棘球蚴，寄生在人和动物的肝、肺和其他器官所导致的一种人畜共患寄生虫病。主要引起寄生部位机械性压迫、毒素作用和过敏反应等。该病呈世界性分布，主要在以畜牧业发展为主国家和地区流行，全球至少有100个国家存在包虫病疫情，被OIE列为法定报告动物疾病，在我国被列为人畜共患二类动物疫病[1]。我国是包虫病的高发国家之一，严重流行地区包括新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙古、西藏和四川等7个省和自治区，占全国面积的44%[2]。

该调查在北疆昌吉、阿勒泰、伊犁地区的牛羊屠宰场采集肝肺细粒棘球蚴包囊组织，对其线粒体细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ基因（cox1）和线粒体NADH脱氢酶Ⅰ基因（nad1）的核苷酸序列进行分析，以期阐明北疆三个地区细粒棘球蚴病的流行情况和种群的遗传与变异特征。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年4月至2019年9月，在北疆昌吉、阿勒泰、伊犁三个地区牛羊定点屠宰场，对牛羊肝脏和肺脏进行细粒棘球蚴包囊采集。将采集的包囊囊液、生发层、原头节分别装于离心管，保存于-80℃冰箱，备用。

1.2 主要试剂

基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），Prime STAR HS（premix）（TAKARA，日本），Gel Red核酸染料（BIOTIUM，美国），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 基因组提取

用基因组提取试剂盒按照产品使用说明书对处理后的包囊样本生发层进行基因组DNA提取，提取的DNA于-20℃保存，备用。

1.3.2cox1和nad1基因PCR扩增与序列测定

以基因组为模板，用于扩增线粒体cox1和nad1基因部分序列的保守引物序列为Ohiolei等[3]实验中使用的两对引物。用于扩增cox1基因的上游引物：5′-ATTATAGAAAATTTTCGTTTTACACGC-3′，下游引物：5′-AAGCATGATGCAAAAGGCAAATAAACC-3′。用于扩增nad1基因的上游引物：5′-ATTATAGAAAATTTTCGTTTTACACGC-3′，下游引物5′-ATTCACAATTTACTATATCAAAGTAACC-3′。反应体系为 Prime STAR HS（premix）12.5 μl，上、下游引物各 1 μl，模板 1 μl，用去离子水补齐为 25 μl，混匀并短暂离心。PCR程序为：95℃预变性5 min，98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃再延伸10 min。同时，以ddH2O代替模板DNA作为空白对照。反应结束后，取5 μl PCR扩增产物与1 μl的点样缓冲液混合，在1.2%琼脂糖凝胶中，以1×TAE缓冲液电泳。电泳结束后，用凝胶成像系统观察目的基因条带，记录阳性鉴定结果并拍照保存，将阳性PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。

1.4 系统发育分析

从成功测序的样品选取cox1和nad1基因的1 649 bp和894 bp的核苷酸序列，通过BLAST比对判断基因型，再使用UGENE与GenBank数据库中的细粒棘球绦虫G1、G3、G4、G5、G6、G7、G8基因型及多房棘球绦虫（E.multilocularis）、少节棘球绦虫（E.oligarthra）、石渠棘球绦虫（E.shiquicus）、伏氏棘球绦虫（E.vogeli）、狮棘球绦虫（E.felidis）、泡状带绦虫（Taenia.hydatigena）的参考序列进行比对。利用Dna SP分别对cox1和nad1基因序列分析单倍型，再利用MEGA5 对cox1和nad1的所有单倍型序列分别构建系统进化树。利用Popart对cox1和nad1基因的所有单倍型分别构建单倍型网络图。

2 结果

2.1 不同地区细粒棘球蚴感染情况

通过现场采集样本，从昌吉、阿勒泰、伊犁三个地区210头牛和2 294只绵羊分别采集24、8、24份脏器的40、13、25个疑似包囊样本；确诊宿主40例，确诊包囊样本共有62个，平均感染率为1.60%；其余包囊已钙化，其中牛源钙化囊占60%（3/5）、绵羊源钙化囊占25.49%（13/51）；1头牛和13只绵羊包囊样本中可以分离出原头节，为可育囊。昌吉的细粒棘感染率最高，感染率为3.85%（24/624）；其次是伊犁，感染率为0.87%（10/1 144）；阿勒泰的感染率最低，感染率为0.82%（6/736）（表1）。

表1 不同地区牛羊细粒棘球蚴感染情况

2.2 细粒棘球蚴基因型的确定

PCR产物电泳后，使用凝胶成像系统观察，共36只绵羊和4头牛的样本可观察到目的条带，其中源自37个宿主的57个包囊样本呈现cox1基因扩增条带阳性（1 800 bp处）；源自39个宿主的59个包囊样本呈现nad1基因扩增条带阳性（1 400 bp处）。经过BLAST比对，cox1和nad1基因测序结果均为G1基因型。

2.3 细粒棘球蚴单倍型特征

将PCR扩增成功的57条cox1基因序列和59条nad1基因序列进行单倍型分析。利用Dna SP分析，本试验中57个包囊样本cox1基因序列归为25个单倍型，将它们命名为Hap1至Hap25，并将它们连同其他基因型和其他虫种一起构建系统进化树（图1）。阿勒泰地区羊肝脏（ALTY26）样本的6个包囊样本、昌吉地区羊肺脏（CJY34）样本的2个包囊样本匀归为Hap1；昌吉地区羊肝脏（CJY16）样本的10个包囊样本归属4个不同的单倍型，它们分别是 Hap4（6/10）、Hap5（1/10）、Hap6（2/10）、Hap12（1/10）；昌吉地区羊肝脏（CJY11）样本的4个包囊样本都属于单倍型Hap10；从昌吉地区羊肝、肺脏（CJY8）样本分别采集的2个包囊样本都归属于单倍型Hap21；从伊犁地区羊肝、肺脏（YNY39）样本分别采集的2个包囊样本分别归为单倍型Hap13和Hap25（表 2）。

本试验中59个包囊样本nad1基因共有8个单倍型，命名为Hap1至Hap8，并将它们连同其他基因型和其他虫种一起构建系统进化树（图2）。阿勒泰地区羊肝脏（ALTY26）样本的6个包囊、昌吉地区羊肺脏（CJY34）样本的4个包囊、昌吉地区羊肝脏（CJY11）样本的3个包囊、昌吉地区羊肝、肺脏（CJY8）样本的分别2个包囊、伊犁地区羊肝、肺脏（YNY39）样本的分别2个包囊都归类为单倍型Hap1；昌吉地区羊肝脏（CJY16）样本的9个包囊分别归属于单倍型 Hap1（2/9）、Hap3（5/9）、Hap4（2/9）（表2）

图1 cox1基因单倍型进化树

图2 nad1基因单倍型进化树

cox1基因单倍型以Hap1为主，占26.32%（15/57），其中Hap1单倍型在阿勒泰包囊样本中占70%（7/10），在昌吉包囊样本中占18.91%（7/37）、在伊犁包囊样本中占10%（1/10）；Hap2、Hap3、Hap7只发现于阿勒泰包囊样本中；Hap13、Hap18、Hap23-25只发现于伊犁包囊样本中；其余单倍型只发现于昌吉包囊样本中（表2）。nad1基因单倍型以Hap1为主，占77.97%（46/59），其中阿勒泰包囊样本占90%（9/10）、昌吉包囊样本占68.42%（26/38）、伊犁包囊样本占100%（11/11）；Hap3-8单倍型只发现于昌吉包囊样本中（表2）。

表2 cox1和nad1基因序列单倍型归属及样本分布

2.4 cox1和nad1基因单倍型网络图特征

根据cox1基因单倍型网络图（图3-a）所示：Hap1是网络图中心，其他单倍型由Hap1连接；在网络图中，Hap1是最大单倍型群体，Hap12、Hap18、Hap24与Hap1遗传距离较远，并有相似遗传距离，表明它们遗传相关性很弱；与Hap12遗传距离最近的是Hap5，因此 Hap12可能是 Hap5的分支；Hap18、Hap17与Hap23有一个突变位点位置相同，但Hap23的突变方式不同；Hap13与Hap10、Hap14有一个相同突变位点，同时Hap13与Hap9有一个相同突变位点；Hap14与Hap10遗传距离最近，因此Hap14可能是Hap10的分支；Hap1与Hap3、Hap14、Hap17、Hap21、Hap24之间有两个突变位点，Hap1与Hap13、Hap15之间有三个突变位点。

根据nad1基因单倍型网络图（图3-b）所示：Hap1是网络图中心，其他单倍型由Hap1连接；在网络图中，Hap1是最大单倍型群体，Hap1与Hap5、Hap6之间有两个突变位点，表明它们遗传相关性较弱；单倍型Hap2、Hap3、Hap4、Hap7和Hap8与Hap1只有一个突变位点，表明它们遗传距离较近；单倍型Hap2由2个样本的序列组成，它们分别来自阿勒泰和昌吉地区的包囊样本。

图3 cox1和nad1基因单倍型网络图

3 讨论

本调查结果显示，阿勒泰、伊犁和昌吉三个地区牛羊包虫病感染率分别为0.82%、0.87%、3.85%，明显低于2012年吕建忠等和2014年努斯来提·依不拉音等的调查[4-5]。主要原因是近年来政府和相关部门大力宣传，农牧民防范意识增强，包虫病获得有效控制。另外，棘球蚴经过1年左右的时间才能发育为肉眼可见的包囊[6]，多数羊被感染后在发育为棘球蚴包囊之前就已经被屠宰，这可能也是本次调查感染率低的原因。该调查采集牛、绵羊宿主（5、51）的包囊样本，其中牛源钙化囊占60%（3/5）、绵羊源钙化囊占25.49%（13/51）；1头牛和13只绵羊的包囊样本中可以分离出原头节，为可育囊。结果表明牛包囊钙化率比绵羊高，绵羊可育囊比牛多，这是由于绵羊为细粒棘球绦虫G1基因型最适宜的中间宿主，而且随着近年来上述地区牛羊科学饲养的推广，驱虫防疫规范，牛羊体质增强，破坏了免疫逃避，免疫细胞容易侵入包囊，使其感染发育不久便开始钙化。

本试验中，cox1基因序列变异率高于nad1基因，且所有样本均鉴定为G1基因型。G1基因型可根据cox1基因和nad1基因核苷酸序列变异分为不同单倍型[7]。cox1基因共有25个单倍型，Hap1是最常见的单倍型，核苷酸序列与先前报道的澳大利亚[8]、土耳其[9]、墨西哥、阿根廷、伊朗[10]等很多国家单倍型核苷酸序列相同，这表明此单倍型分布广泛。Hap2与西班牙报道的序列相同[11]，Hap9和Hap19与意大利和巴西报道的序列相同[10]，其他单倍型目前尚未见到报道。Hap2、Hap3、Hap7仅发现于阿勒泰，Hap13、Hap18、Hap23-Hap25仅发现于伊犁，其余的单倍型仅发现于昌吉。nad1基因共有8个单倍型，Hap1是最常见的单倍型，核苷酸序列与先前报道的阿尔及利亚、意大利、哈萨克斯坦等国家的相同[10]；Hap2、Hap4、Hap7 与在西藏报道的序列相同[12]；Hap3、Hap5、Hap6和Hap8的序列目前尚未见到报道；Hap3-Hap8仅发现于昌吉。这表明同一地区的虫株具有相似的遗传背景，而不同地区之间的虫株遗传背景差异比较大。本试验发现同一宿主可感染不同的单倍型，究其原因可能是其感染了不同来源的虫体排出的虫卵，虫卵可能来自同一条犬感染的不同虫体，也可能是来自不同犬感染的不同虫体，这揭示了细粒棘球绦虫在草原牧区生态环境下传播的复杂性，有待进行进一步的研究。

新疆牛羊主要流行G1基因型，除了G1基因型，2019年Guo等[13]利用cox1基因分析伊犁、塔城和乌鲁木齐羊源样本中还发现G3基因型。本调查在阿勒泰、昌吉和伊犁所采集的样本进行cox1和nad1基因序列分析，均鉴定为G1基因型，未发现G3基因型，但cox1基因多态性比Guo等鉴定15个单倍型的较丰富。结果显示：北疆部分地区细粒棘球绦虫G1基因型基因多态性较丰富，说明细粒棘球蚴有广泛中间宿主适应性，在长期进化演变过程中，寄生虫在与宿主之间互相适应中发生变异，并且在驱虫药及免疫预防的选择压力作用下，促使它们发生变异，其变异累积的进化可能导致出现抗原变异，进而影响对家畜包虫病驱虫效果、诊断检测和免疫预防[14]。

4 结论

该调查中，北疆阿勒泰、昌吉和伊犁等三个地区所鉴定的牛羊细粒棘球蚴均为G1基因型，并且感染率比之前文献报道的有所下降。通过包囊样本cox1基因和nad1基因序列进行多态性分析，发现同一宿主可感染不同的虫卵。