铁死亡的发生机制及其在非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎发生发展中的作用

刘鸣昊， 刘素彤， 张丽慧， 顾亚娇， 尚东方， 肖 准， 赵文霞

河南中医药大学第一附属医院 脾胃肝胆科， 郑州 450000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是最常见的慢性肝病之一，疾病谱从单纯性脂肪变到脂肪性肝炎，晚期纤维化和肝硬化[1]。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是最严重的NAFLD形式，也是临床干预的关键节点。研究[2]表明，肝细胞内脂质积累引发的细胞程序性死亡是导致肝组织损伤和炎症的可能原因。而铁死亡是NASH中最先发生的细胞死亡形式。特异性抑制铁死亡，肝组织炎症几乎被完全抑制[3]。铁死亡可能是NAFLD向NASH转化的重要机制。本综述概括了铁死亡的发生机制及在NAFLD/NASH中的作用(图1)，并对铁死亡的研究提供实验建议。

铁死亡是一种铁依赖性、以脂质活性氧(ROS)堆积为特点的非凋亡形式的细胞死亡方式[4]。其发生机制已被部分揭示[5]：其一，超载的铁离子通过芬顿反应产生大量羟基自由基，从而催化一系列氧化应激反应，造成细胞核、细胞膜、细胞器、蛋白质等破坏；其二，脂代谢途径通过诱发脂质过氧化最终导致铁死亡；其次，大量的抗氧化剂GSH被脂质过氧化物和氢过氧化物消耗，造成GPX4失活。其中GSH的耗竭和GPX4的失活被认为是铁死亡过程中促进脂质过氧化反应的必要因素。System Xc-作为抗氧化系统上游关键蛋白，主要调节谷氨酸与半胱氨酸的转运平衡和参与GSH的合成。铁稳态失衡、脂质过氧化及SLC7A11-GSH-GPX4轴失衡为铁死亡发生的“三大标志”。

1 铁稳态失衡与铁死亡

铁作为一种必需的微量元素，对维持机体正常生理功能至关重要。例如氧气运输，线粒体呼吸，DNA复制和细胞信号传导。正常状态下[6]，由小肠上皮细胞吸收的或红细胞降解释放的Fe2+被氧化为Fe3+，Fe3+经膜上转铁蛋白及其受体作用后被内吞入细胞内，继而被还原为Fe2+，在二价金属离子转运蛋白1的作用下以铁蛋白轻链多肽、铁蛋白重链多肽组成的铁储存蛋白复合物的形式储存在细胞内不稳定铁池中。剩余的部分Fe2+则被氧化为Fe3+转出胞内，以转铁蛋白-Fe3+复合物的形式参与体内的铁循环过程，以维持体内铁的动态平衡[7]。但是，当细胞内存在过量的游离Fe2+时，将通过芬顿反应导致羟基自由基的形成[8]。诱导DNA，蛋白质和脂质的破坏引起细胞毒性。 除了铁池积累外，影响铁稳态的相关基因也参与铁死亡。例如NCOA4[9]，一种负责将铁蛋白重链多肽招募到自噬小体从而使溶酶体降解铁蛋白、释放铁的运载蛋白，导致游离铁释放货物受体。当铁含量丰富时，NCOA4与E3泛素连接酶 HERC2相互作用，促进NCOA4的泛素化和降解。当NCOA4或自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG)(例如 ATG3、ATG5、ATG7 和 ATG13)基因敲减后，则能够抑制由Ⅰ型铁死亡激活剂Erastin诱导的铁蛋白降解、铁积累和脂质过氧化及铁死亡，而NCOA4的过表达能够促进铁死亡的发生。研究[10]发现，Beclin1可以通过直接与System Xc-核心成分溶质载体家族T成员11(SLC7A11)结合抑制System Xc-活性，促进Erastin诱导的铁死亡。在Beclin1过表达处理的细胞中，铁含量增加，GSH耗竭严重，同时脂质氧化应激反应加重，Beclin1-SLC7A11复合物表达增多，促进细胞死亡；相反，Beclin1基因敲减后，铁沉积减少，铁蛋白表达增加，抗氧化剂GSH增加，脂质氧化应激反应相关蛋白SLC11A2、SLC40A1等表达减少，同时阻碍Beclin1-SLC7A11复合物形成，细胞铁死亡减少。同样，体内或体外实验中均发现，Beclin1 激活肽 Tal-Beclin1 干预能够促进 Erastin 诱导的铁死亡，进而促进癌细胞死亡[11]。

注：a,System Xc—GSH-GPX4轴与铁死亡发生机制；b，脂质过氧化与铁死亡发生机制；c，铁稳态失衡与铁死亡发生机制。NCOA4，自噬特异性识别蛋白核受体辅激活因子4；TCA循环，三羧酸循环；Fe2+，二价亚铁离子；Fe3+，三价铁离子；GSH，谷胱甘肽；GPX4，谷胱甘肽过氧化酶4。

2 脂质过氧化驱动铁死亡的发生

铁死亡由致命的脂质过氧化作用驱动，可以通过药物或遗传手段直接阻断脂质过氧化来阻止其发生。脂质过氧化又分自发氧化和酶催化。脂质的自发氧化[12]是一种自由原子团驱动的链式反应。 多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)的氢被羟基获取后形成以碳为中心的脂质原子团(L-)。氧分子与L-的迅速反应产生脂质过氧化原子团(LOO-)。随后，LOO-从临近的PUFA获取氢形成氢过氧化物(LOOH)和一个新的L-，LOOH在Fe2+的协作下转化成烷氧基原子团(LO-)。这些新的L-与LO-可以与邻近的PUFA反应引起另一次链式反应。这个自发的过程是由铁和氧气催化的，当阻止脂质过氧化的分子监护机制失灵时，膜被毁掉、细胞死亡。酶催化的脂质过氧化是PUFA被引导到膜磷脂和中性脂质中， 产生大量脂质过氧化产物4-羟基壬烯酸(4-HNE)和丙二醛、磷脂LOOH以及各种被氧化和修饰的蛋白质[13]。这些产物可能导致膜结构完整性被破坏，从而导致细胞死亡。这个过程需要脂代谢的酶催化才能完成。脂酰辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3)是驱动铁死亡的重要脂代谢酶[14]。ACSL4催化长链PUFA(包括花生四烯酸20∶4和肾上腺酸22∶4)和辅酶A连接。这些产物会被LPCAT3酶重新酯化为磷脂，从而增加细胞内长链PUFA在脂质和膜结构中的掺入[15]。研究[16]证实，在三阴性乳腺癌的一个细胞亚群中，ACSL4的表达水平与其对于铁死亡诱导剂的敏感性相关，且在耐药的间充质癌细胞和透明细胞性肾癌细胞中观察到了类似的相关性。抑制ACSL4表达或许是细胞对铁死亡脱敏的主要机制。相反，增加ACSL4表达或提高其活性，可能会在多种病理生理条件下促进铁死亡，例如缺血-再灌注损伤(一种与铁死亡诱导密切相关的病理状态)以及对辐射的响应[17]。另外，某些脂加氧酶(LOX，非血红素依赖性的靶向PUFA的双加氧酶)，能够直接氧化生物膜中的PUFA及含PUFA的脂质，提示LOX可能介导铁死亡的诱导过程[18]。敲除Alox15或应用LOX抑制剂黄岑素(baicalein)可以保护小鼠免受缺血性脑损伤[19]。最近的研究[20]表明细胞色素P450氧化还原酶在启动脂质过氧化中发挥作用。P450通过促进PUFA脱氢或者通过将Fe3+还原为Fe2+，直接或间接启动脂质过氧化反应。

3 System Xc--GSH-GPX4轴

System Xc-系统由二硫键连接的异二聚体SLC7A11(xCT)和SLC3A2(4F2hc)组成，它可以输入细胞外氧化形式的半胱氨酸，即胱氨酸，交换细胞内的谷氨酸[21]。胱氨酸是GSH合成所必需的，抑制胱氨酸的输入，可以最大程度地耗竭细胞内GSH的水平。GPX4可以抑制复杂脂质(如磷脂和胆固醇)的氢过氧化反应，即使当磷脂和胆固醇被嵌入到膜和脂蛋白中时也可以发挥抑制作用。通过耗竭细胞内的GSH(GPX4必备的协同分子)等直接或间接靶向膜的机制。GSH是三肽形式的抗氧化剂，可以作为硒依赖性GPX4的协同分子，辅助GPX4减少脂质氢过氧化物。因此，通过Erastin耗竭GSH间接灭活GPX4，导致有毒的脂质自由基ROS的积累，进而促进脂质过氧化[22]。在细胞中过表达GPX4使得细胞抵抗RSL3诱导的铁死亡，而敲低GPX4促进铁死亡[23]。其他化合物如ML162、withaferin A(WA)和食品药品管理局批准的抗癌药altretamine也可以通过灭活GPX4诱导铁死亡[24]。FIN56[25]通过结合并激活参与胆固醇合成的鲨烯合酶促进铁死亡。这将导致对一些代谢物，如脂溶性抗氧化剂辅酶Q10(coQ10)和Sec-tRNA的抑制，导致耗竭或灭活GPX4。类似地，敲除GPX4会导致脂质氧自由基的迅速累积，而这些脂质氧自由基可以被亲脂原子团陷阱和铁螯合剂抑制。

4 铁死亡与NAFLD/NASH

越来越多的证据[26]表明，铁死亡在NAFLD/NASH中的潜在生理作用。早在2012年就有学者[27]发现，NAFLD患者血清铁>1.5倍正常值上限与患者肝脏铁沉积和组织学炎症密切相关，认为血清铁水平的升高是NAFLD向NASH及纤维化进展的独立危险因素。冯烨等[28]也发现，NASH患者的血清铁蛋白水平明显升高，认为NASH和肝脏铁代谢异常之间存在某种联系。服用维生素E能够改善NASH患者的肝脏铁积聚和脂质过氧化，并降低血清转氨酶水平，减少肝脂肪变性，从而改善NASH 。Violi等[29]给予蛋氨酸/胆碱缺乏饮食(MCD)诱导的NASH模型小鼠RSL3(一种铁死亡诱导剂)后发现肝脏脂肪变性有所加剧，而给予用亚硒酸钠(GPX4激活剂)或Fer-1治疗后，NASH严重程度显著降低。更有研究[30]表明，在缺乏胆碱、补充乙硫氨酸(CDE)饮食的NASH小鼠模型中，铁死亡是引发NASH的先发事件，并且铁死亡的发生先于其他类型的细胞死亡，而铁死亡抑制剂可抑制此模型鼠肝脏细胞的铁死亡，并抑制了随后的免疫细胞浸润和炎症反应。

4.1 脂质过氧化驱动铁死亡参与NAFLD/NASH NAFLD初期肝细胞内脂滴沉积，诱发脂肪变性，肝细胞内大量游离脂肪酸(FFA)转变成脂酰CoA，然后进入线粒体进行β氧化。脂质贮积增多，肝脏对FFA摄取的增加使线粒体β-氧化速度代偿性增加，进而增加ROS的产出，当超过抗氧化物质的清除能力导致ROS蓄积时，此时ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的PUFA的侧链及核酸等大分子物质反应形成有毒的脂质，从而使细胞膜的流动性和通透性、线粒体的结构和功能发生改变，最终破坏膜的稳定性[31]。这种脂类的氧化和抗氧化系统的失衡引起的脂类酸败过程叫做脂质过氧化。随着NAFLD的发展，脂质过氧化产物会攻击肝脏中最丰富的肝细胞，在Fe2+的参与下引发肝细胞程序性死亡，通过亚致死性和致死性应激效应引起肝细胞的损伤。脂质过氧化反应不仅造成肝细胞的损伤还可以消耗细胞内的抗氧化物，导致GSH和维生素E缺乏，形成氧化失衡的恶性循环。

4.2 铁过载诱发铁死亡参与NAFLD/NASH发生 肝脏是机体重要的储铁器官，肝组织铁代谢失调导致大量游离铁的产生，使肝内细胞对铁死亡的敏感性显著提升[32]。胞内不稳定Fe2+增多后通过芬顿反应促进了羟基自由基的形成，诱导了长链PUFA的消耗，促进轻度小泡产生和大泡脂肪变性从而诱发肝脂肪变性和炎症。有证据[33]表明体内铁储存量和胰岛素信号之间存在相关性，铁超裁可能加剧胰岛素抵抗，而后者是NAFLD/NASH的主要特征。脱铁治疗对NAFLD、糖尿病有显著疗效。可改善胰岛素抵抗，促进胰岛素分泌、肝脏酶水平异常。此外，铁过载能够激活肝星状细胞，而后者是肝脏纤维形成的核心并最终导致肝硬化[34]。

5 铁死亡与肝脏炎症

研究发现, 细胞发生铁死亡后会释放相关因子激活固有免疫系统，并通过识别不同模式细胞死亡的机制来激发炎症反应。在Qi 等[35]的NASH进展小鼠模型中，使用GPX4抑制剂RSL-3(铁死亡诱导剂) 治疗后，促炎因子TNFα、IL-1β和IL-6水平均显著升高，组织病理学显示肝脂肪变性、小叶炎症等明显; 给予甲磺酸去铁胺盐可消除 RSL-3对小鼠的影响，使用亚硒酸钠(GPX4 激活剂)或Liproxstatin-1(GPX4 激活剂)治疗可抑制小鼠肝脏脂质过氧化，同时降低NASH的炎症程度。在Tsurusaki等[36]建立的NASH小鼠模型中，罗格列酮(ACSL4 抑制剂) 和去铁酮 (铁螯合剂) 的作用得到了验证，罗格列酮和去铁酮联合治疗后小鼠肝损伤的血清标志物水平显著降低，炎症细胞浸润被显著抑制。可见，铁死亡抑制剂可以完全保护肝细胞免于死亡，并抑制免疫细胞浸润和炎症反应，表明铁死亡是NASH发病的触发因素。

6 铁死亡的研究方法和技术手段

铁死亡尚无法通过明确的特异性标志物直接证明，只能利用辅助证据证明其发生。例如细胞水平检测细胞活性、Iron Assay Kit(试剂盒)检测细胞、组织中的铁水平；ROS以及ROS的产物(4-HNE等)；分子水平检测与铁死亡相关的蛋白表达如GPX4、ACSL4、COX2等；形态学使用电镜观察线粒体形态、线粒体脊、膜密度等；TMRE荧光染料检测线粒体膜电位——TMRE能够特异性标记有活性的线粒体，是一种细胞膜可穿透性的，正电荷的，橘红色荧光染料。当线粒体膜电位降低时，荧光减弱。另外较为直接的证据是能够被铁死亡抑制剂抑制，铁死亡抑制剂主要包括铁螯合剂(去铁胺、环吡酮胺等)、抗氧化剂(Ferrostatin-1、Trolox、丁羟甲苯等)。

7 展望

大量研究证实，铁死亡参与NAFLD/NASH的进展。然而，还有很多问题需要进一步阐明。铁死亡的生理功能是什么？脂质过氧化反应是如何通过损伤细胞膜导致铁死亡发生的？这些影响脂代谢调控的酶是必需的吗？目前还缺乏像反映细胞凋亡(如caspases家族激活)、自噬(如自噬溶酶体形成)等类似指标来直观反映铁死亡的特异性标志物。为了更详尽地了解铁死亡的机制及找到更准确地判断铁死亡检测方法，未来还需要更多的实验数据来支持有关铁死亡的相关研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：赵文霞负责拟定题目和文章框架：刘素彤负责撰写论文；张丽慧、顾亚娇、尚东方、肖准负责修改论文；刘鸣昊负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。