内蒙古自治区马铃薯常见品种差异性分析

孙宇燕，李树生，郝文胜，梁东超，刘 羽，昊 翔，徐 畅，张龙梅，侯佳秀，马丽荣

(内蒙古自治区农牧业技术推广中心，内蒙古 呼和浩特 010000)

马铃薯(Solanum tuberosum L.)原产于南美洲，因高产、适应性广、营养成分全和产业链长而受到全世界的高度重视[1-2]。中国是世界第一大马铃薯生产国,总栽培面积约600 万hm2, 年产量在9000 万t,在我国是仅次于水稻、玉米、小麦的重要粮食作物[3]。目前，我国主栽马铃薯品种为四倍体植株，在马铃薯育种上,大多数采用大田杂交的方法,选育出了一批优良性状的品种[4-5]。但由于马铃薯的材料比较单一, 性状优良的亲本匮乏，以及杂交技术的影响，长久以来大大降低了育种工作效率[6-7]。

随着我国生物技术的发展，分子标记辅助育种逐步成为了我国农作物育种的一个重要方向[8-9]。

简单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR)是近年来广受学者欢迎的新型分子标记技术[10]。 相比其他常用的标记技术,SSR 标记具有稳定性好、 准确性高等优点, 被广泛运用于农作物品种鉴定及指纹图谱构建中[11]。 其余是以目的基因片段为模板，进行PCR 扩增。 这种方法已在玉米、小麦、甘薯等多种农作物体内研究应用[12-14]。

陈其福等[15]以14 个菜豆品种为材料,采用SSR分子标记技术,对其进行遗传多样性研究,并建立了特异性指纹图谱。 温贺等[16]采用已报道的66 对SSR 引物对不同来源的42 份紫苏材料进行扩增，对紫苏遗传多样性及种群划分进行研究,充分证明了SSR 分子标记在作物辅助育种，以及亲缘关系鉴定等方面的重要作用。

本文利用SSR 分子标记技术对内蒙古常见的36个马铃薯品种进行基因组扫描,对遗传差异性进行分析，旨在为马铃薯分子辅助育种、图谱构建、品种鉴定等方面提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以布尔班克等共计36 份品种为试验材料（见表1）。

表1 36 份试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 马铃薯基因组DNA 提取及检测。选取马铃薯新鲜嫩叶，采用TIANGEN 新型植物基因组DNA 提取试剂盒提取材料的基因组DNA 并用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA 质量进行检测，挑选条带清晰完整、亮度好的DNA 于-20℃保存备用。

1.2.2 SSR-PCR 反应。STM1053、STM0030、STM1049、STM1104、STM1106、STM2022、STM2013、STM0037、STM0019、STM3012、STM3023、STM1053、STM1053 共13 对SSR 引物序列来自Ghislain M （Chislain M et al,2014）等，由华大基因公司合成。

PCR 反应体系采用于卓等[17]的体系略有改动，具体为2×Taq PCR Master Mix 5 μL，50 ng/μL 上、下游 引 物 各1 μL，100 ng/μL 模 板DNA 1 μL，ddH2O 12 μL，共计20 μL。

PCR 运行程序设置为：

1.2.3 电泳检测。（1）电泳过程：将凝固好的变性胶固定到电泳仪上，上下两极倒入1.0×TBE 缓冲液（没过胶面），利用洗耳球吹除拔梳子所留残胶，PCR 扩增产物加入PAGE 变性剂5 μL, 在PCR 仪中95 ℃变性5 min 后，向点样孔中点入6 μL，70 W 恒功率电泳1～1.5 h。 （2）显影步骤：

1.2.4 SSR 数据统计分析。根据电泳结果中条带的有无，采用“0/1”系统对扩增后清晰易读的条带进行记录，在相同的迁移位置上有带记为“1”，无带记为“0”，按基因片段由大到小的顺序记录，构建“0，1”矩阵。利用qtree 1.6.1 分析软件。利用MEGA X 软件，按照距离法对36 个品种建立进化树。

2 结果与分析

2.1 DNA 检测结果

对提取的群体DNA 进行1%琼脂糖电泳检测（图1），由图可见，提取的DNA 样品条带清晰完整，无降解拖尾现象，未见RNA 和蛋白质污染，DNA 纯度高，符合后续试验要求，将DNA 稀释到100 ng/μL，于-20 ℃保存。

2.2 SSR 多态性引物筛选结果

经筛选得到可用于下一步分析的引物11 对，具体见表2。

2.3 SSR 扩增结果分析

试验采用11 对SSR 标记引物（表2）对36 份马铃薯材料进行PCR 扩增，结果如表3 所示。

表2 SSR 引物序列

由表3 可知，11 对引物组合共检测到70 个等位位点，其中66 个为多态性位点，多态性百分率94.2%；DNA 扩增产物片段的大小多在300～500 bp之间，表明供试材料的SSR 多态性丰富。 每对引物扩增出的等位位点数为4～9 个，平均每对引物扩增出的等位位点数为6.4 个。 其中（图2），引物STM2013 和STM3023 多态性条带最多，为9 条；引物STM1053 多态性条带最少，仅有2 条。

表3 36 份材料部分SSR 引物扩增结果

表4 构建的马铃薯基因指纹图谱

2．4 聚类分析结果

2.4.1 聚类分析。根据SSR 引物扩增结果，扩增产物以0、1统计建立数据库，利用qtree 1.6.1 分析软件，按照最大似然法进行聚类分析，计算不同马铃薯品种（系）间的遗传距离。

聚类分析结果(图3)表明，在相似系数18 附近，36 份马铃薯品种可分为4 类。

Ⅰ：1（布尔班克）；

Ⅱ：27（V7）；

Ⅲ：14、9、23、34、26、22、21、17、10、11；

Ⅳ：20、35、15、8、19、16、13、24、25、3、4、6、28、18、29、12、2、33、31、30、36、7、32、5。

在以上的分类中，5 号（希森3 号）和32 号（X）聚为一类，4 号（E44 夏坡地）和6 号（夏坡地456）聚为一类，证明用SSR 分子标记能够正确地按照相似性将马铃薯进行分类，为马铃薯杂交育种中亲本的选择和杂种优势的利用提供理论依据。

2.4.2 NJ 进化树。根据SSR 引物扩增结果，扩增产物以0、1 统计建立数据库，利用MEGA－X 软件，按照距离法对36 个品种建立NJ 进化树。

由NJ 进化树（图4）可以看出，8、35 的亲缘性较近，9、23 的亲本亲缘性较近，同时与20、14、9、23 的亲缘相近，36 份马铃薯按照亲本的远缘性分为4 类。

Ⅰ：23、9、14、20、35、8；

Ⅱ：17、10、11、15、22、34；

Ⅲ：21、1、27、30、36、32、5、7；

Ⅳ：26、28、29、18、19、16、13、24、12、2、31、33、25、3、4、6。

3 讨论

中国不是马铃薯原产地，马铃薯资源从世界不同地区引进，经过人工选育后形成现有的品种及品系，因此，在国内不同地方收集的资源不能按地域性聚集在一起。

由于遗传资源狭窄，供试36 份材料聚类分析结果相似性较高，然而11 对SSR 引物的扩增产物所展示出的多态性与决定某个表型的基因是否有关联还有待研究，通过ML 分析聚成一类的品种，其表型关联还需深入研究，NL 分析所产生的进化树，其进化机制也需完善。

4 结论

试验通过11 对引物，扩增内蒙古自治区36 个品种，结果表明，内蒙古主栽品种间存在遗传差异性，但是通过遗传距离进行聚类分析，36 个品种聚合成4类，品种间遗传距离较近；NJ 进化树分析也表明，品种的同源性较大，品种分离进化较小。

本试验仅选取内蒙古部分主栽品种，有局限性，后续会选取其他地域马铃薯资源进行验证，以期为选择遗传差异大的材料，拓宽马铃薯后代遗传背景，提高后代杂种优势，培育优良的新品种发挥重要作用，为马铃薯的育种亲本和杂种优势提供理论依据。