基于GEO芯片挖掘联合网络药理学分析解毒化瘀颗粒治疗肝癌的分子机制

姚元谦，吕建林，柳琳琳，毛德文，黄 娴，黄小英

(1. 广西中医药大学，广西 南宁 530001；2. 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，主要为肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinona，HCC)，其病情发展迅速，病死率高，5年生存率低于15%。我国属于肝癌高风险地区，主要与慢性乙型肝炎病毒感染及黄曲霉毒素暴露有关，经统计2020年我国肝癌新发病例41万，死亡病例39万，占全球肝癌死亡病例的51%，是我国恶性肿瘤死亡的第二大诱因[1-2]。目前治疗肝癌的手段包括局部的手术、放疗、消融、介入治疗，及全身性的化疗、细胞免疫、靶向药物治疗等[3-5]，手术治疗是肝癌早期的有效治疗手段，可惜大部分患者确诊时已是中晚期，故药物干预是治疗肝癌的重要手段。目前西医治疗不良反应较多，长期服用西药还可能产生耐药性，患者预后不佳[6-7]。中医药治疗肿瘤有着悠久的历史，疗效确切，具有抑制肿瘤生长、提高患者生活质量、减轻临床症状等作用，中西医联合治疗能够减少西药毒副作用，降低术后复发率，延缓病情进展，中医药防治肿瘤有着不可忽视的重要作用[8-9]。解毒化瘀颗粒是毛德文教授在“毒邪病因”原理指导下总结得出的临床经验方，具有解毒祛邪、化瘀消癥之效，全方由茵陈、大黄、白花蛇舌草、赤芍、郁金、石菖蒲组成[10]。此方本是毛德文教授为治疗肝衰竭而立，但其治病机制同样也符合肝癌“毒、瘀、积”的病机治疗[11]。此前研究已表明解毒化瘀颗粒治疗肝疾病时，可通过NO-cGMP、NF-κB、c-Met等信号通路起到调控作用，涉及caspase、TNFR I、Gadd45a、SOCS、TGF-β等作用靶点[12]。本次研究整合GEO基因芯片数据挖掘、网络药理学及分子对接技术，进一步系统地分析解毒化瘀颗粒治疗肝癌的潜在活性成分、作用靶点及调控途径，并进行分子模拟验证。

1 资料与方法

1.1挖掘GEO芯片获取肝癌靶点 以“liver cancer”为关键词，检索GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)筛选相关的基因芯片，获取GSE84402芯片数据集，点击“Series Matrix File”下载芯片数据并下载GPL570基因芯片注释文件。利用R软件对芯片数据进行分组，应用“lima”、“pheatmap”程序包，以|logFC|≥1、adj.P.Val<0.05为筛选条件，获取与肝癌相关的显著性差异基因，分别选取上调基因与下调基因中的前20个基因绘制热图及火山图。

1.2获取解毒化瘀颗粒的活性成分及靶点 通过检索TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、SymMap(www.symmap.org)数据库获取解毒化瘀颗粒中每味药物的活性成分，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件进行收集。通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载各活性成分的3D Conformer数据文件，若PubChem数据库中未收录的活性成分则剔除，将3D Conformer数据上传至SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行药物靶点预测。

1.3筛选共同靶点并构建PPI核心网络 将“1.1、1.2”项下的疾病、药物靶点导入R软件，应用“venn”程序包绘制药物-疾病靶点Venn图，并映射筛选出药物-疾病交集靶点。将交集靶点提交至STRING平台(https://string-db.org/)获取PPI蛋白互作网络，下载该网络数据的TSV格式文件并导入Cytoscape 3.7.2进行拓扑分析，通过Degree值(连接度)的中位数筛选出解毒化瘀颗粒治疗肝癌的核心靶点。

1.4生物信息富集分析 将“1.3”项下的交集靶点上传至DAVID平台(https://david.ncifcrf.gov/)，进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析和基因本体论(GO)功能富集分析，包括生物学过程(BP)、细胞组分(CC)及分子功能(MF)。根据PValue值选取相关度最高的分析结果，应用R软件进行可视化处理。

1.5构建活性成分-靶点-通路网络 为了更清晰地展示解毒化瘀颗粒治疗肝癌的作用机制，运用Cytoscape 3.7.2软件绘制活性成分-基因靶点-作用通路网络图，并通过Degree值预测解毒化瘀颗粒治疗肝癌的主要活性成分。

1.6分子对接验证 选取“1.5”项中主要活性成分的前5个作为小分子配体，选取与这5个活性成分连接度最高且是“1.3”项下的核心靶点作为蛋白受体。从TCMSP数据下载主要活性成分的MOL2文件，从PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载蛋白受体的pdb文件，使用PyMOL软件删除蛋白受体的水分子及配体，运用AutoDockTools1.5.6软件将MOL2文件及pdb文件转换为pdbqt文件，并确定蛋白受体的活性口袋，最后通过AutoDock Vina软件进行分子对接。

2 结 果

2.1肝癌GEO芯片差异基因分析 通过GEO数据库下载GSE84402芯片数据集及基因芯片注释文件，共收集28个样本，其中cancertissue组(肝癌组织样本)14例，non-canceroustissue组(癌旁组织样本)14例。应用R软件对芯片数据进行标准化及分组，并筛选显著性差异基因。共获得差异基因1 423个，其中在肝癌中表达上调的基因480个(如CCNB1、CDKN3、RACGAP1等)，在肝癌中表达下调的基因943个(如FCN2、ABCA8、OIT3等)。分别选取上调基因与下调基因的前20个绘制热图及火山图，见图1及图2，图中绿色为低表达，黑色为中表达，红色为高表达。

2.2解毒化瘀颗粒的活性成分及靶点获取 通过TCMSP、SymMap数据库收集解毒化瘀颗粒中每味中药的活性成分，共获得84个活性成分。将活性成分上传至SwissTargetPrediction数据库进行药物靶点预测，选取每个活性成分中概率前100个靶点进行分析，共获取2 116个药物靶点，经剔除重复靶点后剩余682个。

2.3交集靶点并构建PPI核心网络 将药物-疾病靶点数据导入R软件，绘制Venn图(见图3)，并映射筛选出交集靶点122个。将122个交集靶点上传至STRING平台构建蛋白互作网络，下载该网络数据的TSV格式并导入Cytoscape 3.7.2进行拓扑分析，根据Degree值(连接度)的中位数筛选出核心靶点，包括雌激素受体1(ESR1)(31)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)(24)、细胞色素P450 3A4酶(CYP3A4)(23)、MMP9(21)、雄激素受体(AR)(20)、CYP1A1(20)、蛋白酪氨酸磷酸酶受体C(PTPRC)(19)、胸苷酸合成酶(TYMS)(19)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)(19)、Polo样激酶1(PLK1)(18)等，提示这些靶点在解毒化瘀颗粒治疗肝癌中发挥着关键作用，筛选流程见图4。

2.4生物信息富集分析 将122个交集靶点提交至DAVID平台进行富集分析，结果得到生物学进程条目204条，主要包括药物反应、类固醇代谢过程、外源性代谢过程、环氧酶P450途径等生物进程；得到细胞组分条目33条，主要在胞质、细胞外泌体、核浆等处发挥作用；得到分子功能条目73条，主要包括ATP结合、蛋白同源二聚体化活性、氧化还原酶活性、蛋白激酶结合等；得到信号通路29条，主要富集在化学致癌作用通路、类固醇激素生物合成通路、细胞色素P450对外源性药物的代谢作用通路、花生四烯酸代谢等通路上。应用R软件对主要条目进行绘图，见图5及图6。

2.5构建活性成分-靶点-通路网络 为了更加明确解毒化瘀颗粒治疗肝癌的活性成分、基因靶点与作用通路之间的关系，故构建网络图，见图7。其中橙色圆形节点为靶点，深红色倒三角形节点为通路，淡红色正方形节点为活性成分，节点越大说明连接度值越大。通过网络图可直观看出，解毒化瘀颗粒对肝癌具有多途径、多成分的作用机制。根据Degree值，预测其治疗肝癌的主要活性成分，见表1。

表1 解毒化瘀颗粒治疗肝癌的主要活性成分

2.6活性成分与靶点蛋白的分子对接 选取“2.5”项下的主要活性成分与“2.3”项下的核心靶点进行分子对接验证，运用AutoDock Vina软件进行对接并预测结合能力，结合能越低则构象越稳定。当结合能<0 kcal/mol时表明配体与受体间有结合活性，当结合能<-5.0 kcal/mol时表明结合良好[13]。结果显示，异鼠李素-MMP9(-7.9 kcal/mol)、β-谷甾醇-ESR1(-8.2 kcal/mol)、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌-CYP1A2(-11.3 kcal/mol)、油酸乙酯- PTPRC(-5.7 kcal/mol)、茵陈黄酮- PTGS2(-8.8 kcal/mol)，提示各分子间具有较强的结合活性，见图8。

3 讨 论

解毒化瘀颗粒是毛德文教授多年临证经验凝结而出，全方由茵陈30 g、大黄(后下)15 g、白花蛇舌草30 g、赤芍50 g、郁金15 g、石菖蒲15 g组成，诸药相合，使热去毒解，瘀散痰化，中焦气机升降有序，肝胆疏泄气畅血行，三焦通利，共奏解毒化瘀、生新见长之效[12]。前期研究已表明本方对肝脏疾病有防治作用，本次研究整合GEO基因芯片数据挖掘、网络药理学及分子对接技术，进一步系统地分析解毒化瘀颗粒治疗肝癌的作用机制。

通过PPI网络拓扑分析发现，解毒化瘀颗粒治疗肝癌的核心靶点有ESR1、PTGS2、CYP3A4、MMP9、AR、CYP1A1、PTPRC、TYMS、CDK1、PLK1等[13]。ESR1作为一种癌基因，是多种恶性肿瘤潜在的肿瘤抑制基因，在乳腺癌、非小细胞肺癌及宫颈癌中，ESR1的表达水平明显下调[14-15]。研究表明ESR1也是肝癌的肿瘤抑制基因，低ESR1表达会促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭[16]，相反，ESR1的过度表达可以抑制肝癌细胞发展，同时诱导肝癌细胞的凋亡[17]。PTGS2与炎症反应密切相关，研究认为炎症反应是促进肝癌发展的因素，通过抑制PTGS2/COX-2可以防止黄曲霉毒素驱动肝癌的发生及进展[18]。CYP3A4是细胞色素P450氧化酶家族成员之一，参与肝脏物质代谢过程，60%的临床药物都要经其代谢转化，它能抑制或增加药物活性[19]，研究发现在肝癌患者的肝癌组织中，CYP3A4的表达显著降低[20]。MMP9属于基质金属蛋白酶家族(MMPs)成员，参与正常生理过程中细胞外基质的分解，MMP9与肿瘤的发生及进展有关。当MMP9表达上调降解细胞外基质和基底膜，肿瘤细胞由此进入体循环形成新的肿瘤灶，同时MMP9促进新血管的生成以维持肿瘤生长[21]。有研究认为MMP9在肝癌生长浸润及转移过程中关系密切，可作为肿瘤分子标志物[22]。AR属于核受体超家族中的类固醇受体，实验发现肝癌中的巨噬细胞可能通过改变外泌体中的microRNA(miR-92a-2-5p)来降低肝癌细胞AR的表达，从而促进肝癌细胞的侵袭[23]。TYMS是临床中肿瘤化疗药物的作用靶点，被认为是氟尿嘧啶类药物的主要作用部位[24]，研究发现TYMS基因在肝癌中表达上调，可促进肝癌细胞DNA的合成，使肿瘤生长、扩散[25]。CDK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞周期调控中的重要因子。CDK1在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中表达上调，且与肝癌患者的预后相关，高表达的CDK1肝癌患者其预后较差[26]。

交集靶基因GO功能富集分析显示，解毒化瘀颗粒治疗肝癌主要涉及氧化还原过程、外源性代谢过程、环氧酶P450途径、胞质、细胞外泌体、ATP结合等方面。通过环氧酶P450生物途径能够将花生四烯酸代谢为具有生物活性的类花生酸，类花生酸是包括炎症在内的许多生物过程的关键调节剂，研究认为其能抑制肝脏炎症[27]。细胞外泌体是包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡，其在肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭等方面起着重要的调控作用[28]，正常细胞源性外泌体对肝癌的生长及转移有抑制作用[29]，而肿瘤细胞源性外泌体对肝癌的进展、扩散及耐药性有促进作用[30]。KEGG通路富集分析得到29条信号通路，主要富集在化学致癌作用通路、类固醇激素生物合成通路、细胞色素P450对外源性药物的代谢作用通路、花生四烯酸代谢通路、P53信号通路、VEGF信号通路、PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路等途径上，涉及较多的基因依次为CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、PIK3R1、ADH1B等，其中CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4也是PPI拓扑分析中的核心靶点，都为细胞色素P450氧化酶家族成员之一。目前认为黄曲霉毒素是肝癌的重要诱因之一，黄曲霉毒素是具有剧毒性、致畸性、免疫抑制性的化学致癌物，它可能通过化学致癌途径诱导肝癌发生[31]。P53信号通路与肿瘤的发生关系密切，其重要节点P53基因通常在癌症患者中发生突变或失活，从而导致异常肿瘤细胞增殖[32]。有研究证实，通过miR-29b调控P53信号通路能够抑制肝癌细胞增殖，并诱导肝癌细胞凋亡[33]。PI3K-Akt信号通路是已被确定的对癌症有重要作用的主要信号通路之一，该通路在肝癌细胞中呈过度激活状态，其通路中的节点是靶向药物治疗的重要靶点[34]。

进一步构建活性成分-靶点-通路网络分析发现，解毒化瘀颗粒治疗肝癌的主要活性成分可能为异鼠李素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌、油酸乙酯、茵陈黄酮。异鼠李素与β-谷甾醇均有一定的抗肿瘤作用，能够抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。异鼠李素通过调控癌基因(P53、Survivin、Caspase-3)、肿瘤信号通路(MEK-ERK通路、MAPK/ERK通路)对肿瘤细胞起到治疗作用[35]。研究发现，异鼠李素对人肝癌细胞有抑制作用，通过增强细胞内活性氧水平将肝癌细胞阻滞在G2/M期并诱导其凋亡[36]。试验证明，β-谷甾醇能够增加IL-2、IFN-γ水平，抑制IL-6、IL-10水平，从而抑制肝癌细胞的增殖、转移[37-38]。

最后利用分子对接技术进行虚拟验证，对主要的活性成分与核心靶点进行对接分析，结果显示所有对接结合能均<-5.0 kcal/mol，表示各主要活性成分与核心靶点间具有良好的结合力。

综上所述，解毒化瘀颗粒中的异鼠李素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9、10-蒽醌、油酸乙酯、茵陈黄酮等活性成分，通过上调ESR1、CYP3A4、CYP1A1、PTPRC及下调PTGS2、MMP9、AR、TYMS、CDK1、PLK1等核心靶点，调控化学致癌作用通路、细胞色素P450代谢通路、花生四烯酸代谢通路、P53信号通路、PI3K-Akt信号通路等途径，涉及氧化还原过程、环氧酶P450途径、细胞外泌体、ATP结合等生物功能，从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、扩散及对药物的耐药性。本次分析结果表明解毒化瘀颗粒治疗肝癌具有多途径、多成分、多功能的作用机制，可对未来中医药防治肝癌的研究提供新思路。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。