基于p38MAPK信号通路探讨针刺疗法对脑卒中后抑郁模型大鼠免疫因子的影响

刘丽莉，史 玲 ，冷 凤

(1. 山东中医药大学,山东 济南 250355；2. 威海市中医院，山东 威海 264200)

脑卒中后抑郁是脑卒中后引发的情感障碍综合征，临床表现为睡眠障碍、乏力、焦虑等。流调学显示，脑卒中后抑郁占脑卒中发病患者的近1/3[1]。脑卒中后抑郁发病机制尚不明确，患者多伴有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)等炎性因子表达异常，该病的发生可能与免疫调节异常有关[2-4]。相关研究表明，针刺能够明显改善抑郁模型大鼠的学习记忆功能，调控免疫因子表达，但其作用机制不明[5-6]。寇娜等[7]实验研究发现，下调p38MAPK表达能够抑制炎症因子的释放，从而改善脑卒中后抑郁。基于此，本研究从p38MAPK信号通路角度探讨了电针刺激对脑卒中后抑郁大鼠免疫炎性因子TNF-α、IL-1β及其受体蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)、白细胞介素-1β受体(IL-1βR)表达的影响，旨在为电针治疗该病提供客观依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 3月龄SPF级雌性Wistar大鼠36只，体重(200±20)g，由山东中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(鲁)2020-0001，适应性喂养1周后开始实验。本实验经山东中医药大学动物实验伦理委员会批准，实验过程及操作均遵守国家健康与医学研究委员会(NHNRC)动物道德准则。

1.2仪器及试剂 纤毛机械刺激针(NC12775，美国StoeltingCo.)；HANS-200A 电针仪(南京济生)； Benchmark Plus 酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD公司)；荧光显微镜(DM1000，德国徕卡)；水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂)；TNF-α ELISA检测试剂盒(批号：E202002)、IL-1β ELISA检测试剂盒(批号：E202004)、TRAF6 ELISA检测试剂盒(批号：E202011)、IL-1βR ELISA检测试剂盒(批号：E202010)均为上海联硕生物科技有限公司生产；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(C0003)购自北京普利莱基因技术有限公司；p38 MAPK抗体(YT819)购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.3实验方法 将36只大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组及针刺组，每组12只。模型组及针刺组大鼠均参照文献[8]，采用Koizumi法建立脑卒中模型：采用10%水合氯醛麻醉大鼠后，仰卧位固定大鼠，颈部正中偏右侧备皮，分离颈部肌肉后暴露大鼠气管，从气管右下侧动脉处分离颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，手术线结扎固定后缝合消毒。术后24 h测定神经功能缺损评分，取评分1～3分大鼠进行慢性不可预见性温和刺激+单笼孤养法制备脑卒中后抑郁模型。造模成功后，针刺组将大鼠置于自制鼠袋中固定，参考文献[8]取穴，暴露针刺穴位，将毫针刺入穴位后接电针仪，疏密波，刺激强度2 mA，2 Hz/100 Hz，每次15 min，1次/d，共干预14 d；空白组和模型组大鼠不给予干预。各组大鼠生长环境及饲养条件相同。

1.4检测指标及方法

1.4.1免疫炎性因子水平 各组大鼠处死后心脏取血2 mL，置于离心机中， 3 000 r/min离心(离心半径10 cm)10 min，取上清液，ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6和IL-1βR水平。

1.4.2海马组织中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表达情况

1.4.2.1TUNEL法检测 大鼠处死后，迅速取各组大鼠部分海马组织，剪碎后置于4%多聚甲醛溶液内浸泡24 h，不同浓度乙醇按顺序脱水后进行切片操作，脱蜡后将标本置于苏木精中染色15 min，脱水透明10 min，TUNEL试剂盒检测海马组织切片标本中细胞凋亡情况，激光共聚焦显微镜观察。

1.4.2.2Western blot法检测 取各组大鼠部分海马组织，剪碎后加入RIPA裂解缓冲液放置在冰上30 min，提取海马组织中的总蛋白，然后使用BCA蛋白测定试剂盒测定海马组织中蛋白质的浓度。蛋白质用SDS-PAGE进行等量分离，然后移至PDVF膜上，置于4 ℃下，添加一抗与β-actin(1∶500)孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶缀合的二抗(1∶500)，常温下孵育2 h。使用ECL试剂进行显影，应用QuantityOne软件分析蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1各种大鼠血清免疫炎性因子水平比较 模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6、IL-1βR水平均明显高于空白组(P均<0.05)，针刺组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6、IL-1βR水平均明显低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和脑卒中后抑郁各组大鼠血清免疫炎性因子水平比较

2.2各组大鼠海马组织中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表达TUNEL染色情况 激光共聚焦显示，空白组大鼠海马组织正常，TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表达(绿色荧光)极少；模型组大鼠TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表达明显增多；针刺组大鼠TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表达明显较模型组少。见图1。

2.3各组大鼠海马组织中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白相对表达量比较 模型组大鼠海马组织中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，针刺组大鼠海马组织中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图2。

3 讨 论

中医学将脑卒中后抑郁归为“中风”“郁病”等范畴，辨治该病时多从脑、肝、肾等入手。《内经》指出肝肾同源，“肝藏魂，肾藏志……”说明人类的高级精神、意识及思维活动与肝肾密切相关。肝主情志，肝失疏泄，则情志失养，久之则肝气郁结，痰瘀互结阻塞脑窍；肾气不足，无法生精化髓，脑失充养，则神明失用，从而导致卒中后抑郁发生，临床表现为情志低落、记忆力下降、神情呆滞等。针刺穴位可供气进入、传出、交汇和聚积，常选用百会穴、大椎穴、内关穴、太冲穴治疗神志病，可显著改善抑郁情绪，减轻睡眠障碍[9-10]，但具体机制尚不明确。近年研究发现，针刺可干预中枢以及外周迷走神经，改变中枢内神经递质传递，调节机体免疫相关细胞因子IL-2、IL-4、IL-10等表达[11-12]。

目前研究认为，脑卒中后抑郁发病与免疫因子代谢异常等多种因素有关，其中IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放和机体神经-内分泌-免疫调节网络关系密切，炎症细胞因子水平升高可引起大脑中吲哚胺-2，3-双加氧酶升高，导致海马组织中的5-羟色胺(5-HT) 含量下降，从而诱发抑郁[13-15]。炎症在脑卒中后抑郁发病过程中发挥着重要作用，是修复受损海马组织以保护中枢神经系统的主要生理反应，而p38MAPK信号通路是炎症级联反应的重要途径[16-17]。p38MAPK是一类分化上保守的丝氨酸/苏氨酸MAPK，参与调控基因表达、代谢活动以及细胞的凋亡和分化，其可通过氧化应激、活化炎症因子及触发炎症反应等方式参与大脑、间脑、小脑和脑干的病理生理过程，成为各种脑病的致病媒介。非磷酸化状态的p38无活性，当神经细胞被各种应激因素或炎症因子刺激时，应激信号就会激活MAPK激酶；p38MAPK活化可以结合细胞质中的促凋亡蛋白、炎症受体蛋白等多种反应底物，调控转录因子和特异性细胞因子的表达，诱导细胞分化与凋亡、炎症反应，减缓受损神经元凋亡的进程[18-20]。

本实验结果显示，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、TRAF6、IL-1βR水平及海马组织中TRAF6、IL-1βR、p38MAPK表达量均明显升高，说明脑卒中后抑郁p38MAPK信号通路活化，产生大量炎症因子；针刺组大鼠上述指标水平均明显低于模型组，证实针刺能够调节脑卒中后抑郁大鼠p38MAPK信号通路的活化，进而影响体内免疫因子及其受体蛋白的表达。

综上所述，针刺治疗能够下调卒中后抑郁大鼠体内免疫炎性因子及其受体蛋白的表达，其机制可能与调控p38MAPK信号通路有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。