基于网络药理学对桂枝茯苓丸治疗放射性肺炎的潜在作用机制初探

邹航，李淼，何嘉宁，朱诗雨，翁文浩，赵春阳，蔡佳怡

1.中国医科大学药学院，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学临床一系，辽宁 沈阳 110122；3.中国医科大学附属第一医院，辽宁 沈阳 110001

随着放射治疗在肿瘤治疗中的广泛应用，随之引起的不良反应也愈发严重。肺组织对放射线敏感性高，接收放射线后易发生损伤，导致放射性肺炎和长期肺纤维化的发生，严重影响患者预后水平和生活质量[1]。研究表明，肺癌、乳腺癌、食管癌、恶性淋巴瘤或胸部其他恶性肿瘤经放射治疗后，在放射野内的正常肺组织受到损伤均会出现放射性肺炎相关症状[2]。因此，为了保证放射治疗的顺利进行，对于放射性肺炎的预防、控制与治疗显得尤为重要。

中医将放射性肺损伤归为“肺瘘”，主要辩证理论为热毒之邪[3]。采用放射线治疗的多为肿瘤患者，本身免疫力低下，属于正气不足、瘀血内结，因此应在扶正的前提下益气活血，疏通经络，逐淤散结。本文选择具有临床疗效证据的理气活血方剂桂枝茯苓丸，探索其在治疗放射性肺损伤中的作用[4]。

桂枝茯苓丸出自《金匮要略》，临床上已有其治疗间质性肺炎和放射性肺炎成功的案例。桂枝茯苓丸具有改善血液流变、抗血小板聚集、调节内分泌、抗炎、镇痛、镇静、抗肿瘤等作用。临床研究证明，桂枝茯苓丸能够降低放射性肺炎的发生率、缓解症状。本文通过网络药理学的方法初步探究其作用机制，为放射肺炎的预防与治疗提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 活性成分检索 利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，检索活性成分及其作用靶点(2021 年5 月31 日更新检索)。检索词为“桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍药”。检索条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18。初步筛选获取活性成分，同时删除无明确靶点的成分，然后进一步通过UniProt数据库做标准化处理。

1.2 疾病靶点的筛选 应用在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)和GeneCard 数据库对放射性肺炎的疾病靶点进行检索，检索词为“Radiation pneumonitis”。检索获得靶点，提取Score 值，按照由高到低排列；合并两个数据库的检索结果，去除重复数据。

1.3 活性成分与疾病网络构建与分析 应用R语言中的VennDiagram程序包对成分与疾病网络进行可视化处理。同时将成分、靶点、疾病相互作用的关系导入Cytoscape进行可视化分析。

1.4 蛋白互作网络的构建 将桂枝茯苓丸与放射性肺炎交集基因导入String 数据库中，生物类型设定为Homo Sapiens，得到蛋白互作网络。

1.5 GO、KEGG 富集与分析 通过Bioconductor数据库对筛选获得的交集基因进行GO 和KEGG 富集。应用R 语言中DOSE[5]、ClusterProfiler[6]和Pathview[7]程序包，进行富集分析。

1.6 分子对接 应用AutoDock Vina对小分子与蛋白进行分子对接，应用Pymol 对分子对接结果进行可视化分析。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸活性成分及其靶点检索 应用TCMSP 数据库检索获取活性成分：桂枝7 个，茯苓15个，牡丹皮11个，桃仁23个，芍药29个。删除重复项和没有明确靶点的化合物后，剩余共计85个活性成分。其中生物利用度最高的是白杨糖苷(populoside，OB=108.89%)，最低为芍药内酯苷(albiflorin，OB=30.25%)。DL 值分布在0.19 到0.83 之间，其中去氢齿孔酸(dehydroeburicoic acid)类药性最高。

2.2 放射性肺炎疾病相关靶点的筛选 应用GeneCard获得放射性肺炎相关基因靶点531个，Score值分布在0.22～46.32。最大值46.32为TP53。同时，检索OMIM，得到相关基因6个，合并获得基因537个。

2.3 疾病网络构建与分析 应用R 语言的VennDiagram程序包对成分与疾病网络进行可视化处理，得到桂枝茯苓丸与疾病有64 个交集基因，如表1所示。其中桂枝有3个活性成分作用在3个交集基因上，茯苓有4 个活性成分作用在18 个交集基因上，牡丹皮仅有1个活性成分作用在37个交集基因上，桃仁中12个活性成分作用在同一个靶点上，芍药7个活性成分作用在11个靶点上。

表1 益气活血中药与放射性肺炎基因交集

应用Cytoscape 对活性成分和靶点之间的关系进行分析(图1)，本研究共纳入放射性肺炎相关疾病靶点85 个，中药活性成分30 个，中药5 味，搭建关系网络214 个，其中包括疾病与靶点、靶点与活性成分、活性成分与中药之间的关系。其中，槲皮素(Quercetin)与37 个基因靶点相关，常春藤皂甙元(Hederagenin)与17个基因靶点相关，鞣花酸(Ellagic acid)与8个基因靶点相关，儿茶酸(Catechin)与4 个基因靶点相关，β-谷甾醇(beta-sitosterol)与3 个基因靶点相关。靶点与活性成分关联数排首位的是PTGS2，其与23个成分存在着相关性；VEGFA、PGR、NR3C2、MPO、MMP9、GSTM1和GSTP1均与2个成分存在相关性。

图1 桂枝茯苓丸中药治疗放射性肺炎的活性成分-靶点-通路相互作用网络关系图

2.4 蛋白互作网络的构建 基于String数据库的文本挖掘，共检索到蛋白与蛋白之间的互作关系共计947 条，其中实验论证的相互关系167 条(粉色)，来源于数据库证据89 条(蓝色)，共表达462 对(紫色)，基因同线7对(浅蓝色)，其余黄色线为文本挖掘的基因相关性，见图2。

图2 桂枝茯苓丸中药与放射性肺炎的PPI网络

在蛋白互作网络基因中，核心基因出现在IL-6和AKT1，分别有57 和53 个相互作用。除此之外，MMP9、CXCL8、VEGFA、IL1B、CCL2 和PTGS2 也具有较多的相关基因，分别有52、51、51、50、49 和49 个相互作用。这些靶点的预测对放射性肺炎的防治具有关键的指导作用。

2.5 GO富集与KEGG富集分析 通过生物活性GO 富集初步得到相关性排名前30 的生理过程，按照相关性(P值)排序，排名前十的生理活性分别为：细胞因子生理活性(cytokine activity)、细胞因子受体结合生理活性(cytokine receptor binding)、血红素结合(heme binding)、四吡咯结合(tetrapyrrole binding)、受体配体活性(receptor ligand activity)、信号受体激活剂活性(signaling receptor activator activity)、抗氧化活性(antioxidant activity)、磷酸酶结合活性(phosphatase binding)、生长因子受体结合活性(growth factor receptor binding)、整合素结合活性(integrin binding)。为了明确桂枝茯苓丸的生物活性对应的来源，对五味中药组分进行GO 富集，阐明其在治疗放射性肺炎中可能产生的影响，见图3。

图3 桂枝茯苓丸中药生物活性GO富集柱状图

对得到的交集基因结果进行KEGG富集，并同时对五味中药组分进行富集分析，按P 值排名，前十的通路依次为：糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、膀胱癌(bladder cancer)、HIF-1 信号通路(HIF-1 signaling pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、IL-17 信号通路(IL-17 signaling pathway)、恰加斯病相关通路(Chagas disease)、疟疾相关通路(malaria)、前列腺癌相关通路(Prostate cancer)，见图4。

图4 桂枝茯苓丸中药相关通路KEGG富集柱状图

2.6 分子对接 将筛选出来的小分子和蛋白分别通过AutoDock Vina 软件进行筛选，通过计算机辅助模拟分子对接，得到8 对亲和力较高的小分子与蛋白的相互作用(表2)。其中，亲和力最大的是槲皮素(Quercetin)与ICAM1，亲和力可达-8.9；鞣花酸(Ellagicacid)与GSTM1，亲和力为-8.7；这两个小分子与GSTP1 也有较好的相互作用。黄芩素(Baicalein)与HIF1的亲和力为-7.6；Taxifolin与ICAM1和PTGS2相互作用，亲和力分别为-7.6和-6.7，见图5。

图5 分子对接可视化图

表2 分子对接结果

3 讨论

桂枝茯苓丸出自我国著名医学古籍《金匮要略》，由5味中药组成，含85个活性成分。放射性肺炎共计537 个相关基因，疾病与桂枝茯苓丸活性成分相交基因64个。其中PTGS2为相互作用最多的靶点，可能为作用机制中的重要靶点。其中活性成分槲皮素、常春藤皂甙和鞣花酸与较多的靶点相关，可能为此方剂的主要活性成分。桂枝茯苓丸主要通过细胞因子生理活性、细胞因子受体结合生理活性和血红素结合活性，进一步调节放射性肺炎相关生理过程。其机制主要通过糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路和脂质与动脉粥样硬化通路等进行调控。

关于放射性肺炎的研究仍处于初步阶段，目前放射治疗后产生肺炎和肺纤维化的机制尚不明确，但关注度随着放疗患者的增加而逐年增加。2002 年XAVIER等[8]和CHEN等[9]在研究中证明了放射性肺损伤，特别是放疗后期的肺纤维化与TGF-β通路有关，论证了损伤再修复机制在放射性肺炎中的重要地位。2011年YANG等[10]在International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics 中提出了基因多态性与放射性肺炎的关系。这些关系缺少进一步的论证，大多停留在假说的阶段。为了更好的探索中药复方在放射性肺炎中的作用，本文通过数据库检索筛选出所有的潜在靶点，并对不同的蛋白相互作用进行评分。但与其他常见疾病相比，本文得到的靶点Score值较低，原因可能与相关研究较少，没有充足的证据支持有关。

中医辨证理论在解释放射性肺炎时存在不确定性。中医认为放射性肺炎的主要辨证思想为热毒，可分为以下证型：气阴两虚型、热毒阴虚型、肺燥津亏型、热毒内蕴型、肺络血瘀型及肺肾阴虚型[11]，并没有一个完全对应的中医传统理论，较为接近的是“肺痹”，因而在中医用药选择上分歧较多。益气类中药在预防放射性肺炎的方剂中经常出现，以提高免疫力为主要功效，如参芪扶正注射液[12]。放射性肺炎本身为热毒，有学者提出清热解毒方剂可能存在治疗意义[13]。由于放射性肺炎常表现出郁结症状，因而活血化瘀类药物也成为方剂中重要组成部分，例如川芎、丹参等[14]。

桂枝茯苓丸为理气活血方剂，主要成分为桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和芍药。其中桂枝为主药，可温通血脉，扶正固本，起到调节免疫力的作用。茯苓同为主药，可渗利下行、益心脾之气，有助于改善瘀血症状。桃仁和芍药可清热解毒。在成方的过程中往往加入白蜜作为辅料成丸，具有祛痰祛瘀的功效。因此，桂枝茯苓丸的功效与放射性肺炎的中医辨证理论相一致[15]。

通过对桂枝茯苓丸-放射性肺炎通路相关性的分析，提示其药理机制可能与细胞因子介导的炎性通路、血流动力学相关信号通路以及乏氧因子相关靶点有着密切的关系。细胞因子在非感染性炎症疾病的发病初始阶段起到关键的作用[16]，血细胞黏附及血流动力学改变是放射性肺炎后期肺纤维化形成的重要过程[17]，低氧诱导因子可以调节细胞对于射线的敏感度、降低肺部由于放射线引起的损伤[18]，通过调控上述过程，可能会有效抑制放射性肺炎的进展。

放射性肺炎的发生发展存在多个阶段以及多个影响因素，本文首次对放射性肺炎已知研究的全貌进行总结。通过建立中药经典复方桂枝茯苓丸的小分子库，放射性肺炎的疾病基因库，进一步搭建小分子、靶点、活性成分以及中药复方之间的关系网络，探讨各组分的作用靶点及通路。目前针对放射性肺炎的中药研究依然较少，主要集中在综述以及文献整理，针对机制的研究较少。本文通过网络药理学方法首次进行探索，旨在为放射性肺炎的中药预防以及治疗机制的探究提供新的依据。