利拉鲁肽对糖尿病肾病大鼠肾脏功能和足细胞损伤的改善作用及其机制

祁冰雪, 王杨威, 张艺献, 赵静波, 马 彦, 孙亚东

（1. 吉林省人民医院内分泌科，吉林 长春 130021；2. 吉林大学第二医院肾内科，吉林 长春 130041）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是常见的糖尿病慢性并发症之一，也是导致终末期肾病的主要原因之一。DN 与高血糖介导肾小球足细胞损伤和凋亡密切相关，因此保护足细胞是防止DN发生和发展的关键策略。利拉鲁肽是通过基因重组技术生产的人胰高血糖素样肽1 （glucagon-like peptide-1，GLP-1）类似物，用于2 型糖尿病患者控制血糖，具有明显降低体质量、改善血脂和降低血压的作用。利拉鲁肽还可以促进胰岛β 细胞增殖和再生，减少β 细胞凋亡［1-2］。近年来研究［3］证实：利拉鲁肽具有肾脏保护作用，其抑制血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）诱导的肾纤维化和肾功能衰竭。利拉鲁肽可以通过激活ERKYap 信号通路和上调Sirt3 表达，使系膜细胞免受高血糖诱导的线粒体损伤从而起到保护肾脏作用［4］。关于利拉鲁肽抑制高糖诱导足细胞损伤的作用及其机制也有相关研究［5-6］报道。本课题组前期研究［7］显示：利拉鲁 肽 通 过 激 活 磷 脂 酰 肌 醇 3- 激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt） 信号通路抑制足细胞凋亡，减轻高糖诱导的足细胞损伤。本研究在前期研究的基础上采用动物模型进一步观察利拉鲁肽对DN 大鼠肾脏功能、足细胞相关蛋白表达和病理形态表现的影响，探讨利拉鲁肽保护肾脏的作用机制，为利拉鲁肽干预DN 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器雄性SD 大鼠48 只，体质量110～130 g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。所有动物实验均经过吉林大学动物实验伦理管理委员会批准。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma-Aldrich 公司），兔抗Synaptopodin 多克隆抗体（美国Abcam 公司），兔 抗 PI3K/磷 酸 化 Akt （phosphorylated Akt，p-Akt） 多 克 隆 抗 体、 β -actin 和PI3K 抑 制 剂LY294002（美国Cell Signaling Technology 公司），羊抗兔IgG-HRP 二抗（中杉金桥），利拉鲁肽（丹麦诺和诺德公司），尿白蛋白肌酐比值（urinary albumin creatinine ratio， UACR）、 血 清 肌 酐（serum creatinine， Scr） 和 尿 素 氮（blood urea nitrogen， BUN） 检 测 试 剂 盒（美 国Bioassy Systems 公司）。血糖仪及试纸（德国罗氏公司）。石蜡包埋台 （美国Sakura 公司），石蜡切片机（德国Leica 公司），LKB-1 型超薄切片机（瑞典Leica 公司），日立H-600 型透射电镜（日本日立公司）。

1.2 糖尿病大鼠模型制备48 只雄性SD 大鼠于标准聚丙烯鼠笼中饲养，每笼4只，室温（23±1）℃，相对湿度（50±4）%，12 h 灯照、12 h 黑暗的正常生理周期，自由饮水及进食。饲养1 周后随机抽取12 只作为正常对照组，其余36 只大鼠腹腔注射STZ 溶 液，STZ 总 量 按 照 大 鼠50 mg·kg－1剂 量 按需 称 量，以0.01 g·mL－1柠 檬 酸 钠 缓 冲 液（pH 4.4）溶解浓度为0.01 g·mL－1，于溶解药物后30 min 内腹腔注射完毕。连续给药5 d，每次SD大鼠给药前均需要空腹6～8 h。造模完成后自由进食饮水5 d，大鼠尾尖静脉采血检测血糖值，连续3 次测量，血糖值≥16.7 mmol·L－1时确定为糖尿病大鼠模型制备成功。

1.3 实验动物分组和给药48 只雄性SD 大鼠随机选取12 只作为正常对照组，其余模型制备成功的36 只大鼠再随机分为模型组、利拉鲁肽组和利拉鲁肽+LY294002 组，每组12 只。利拉鲁肽组给予利拉鲁肽（50 mg·kg－1）腹腔注射；利拉鲁肽+LY294002 组先提前给予LY294002（40 μmol·L－1）腹腔注射0.1 mL，30 min 后再给予利拉鲁肽腹腔注射（50 mg·kg－1）；正常对照组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射。各组大鼠每天给药1 次，连续给药8 周。根据观察指标不同分为不同组别：①在正常对照组、模型组和利拉鲁肽组中观察利拉鲁肽对DN 大鼠肾脏组织中足细胞损伤的改善作用；②在正常对照组、模型组、利拉鲁肽组和利拉鲁肽+LY294002 组中观察利拉鲁肽对DN 大鼠肾脏组织中Synaptopodin 蛋白及PI3K/Akt 信号通路转导蛋白表达的影响。

1.4 生化指标检测和肾脏标本采集给药结束后，称各组大鼠体质量。在大鼠空腹状态下，用手抓牢固定大鼠，刺激大鼠膀胱留取尿液标本，连续留取3 d，测定尿液中UACR 水平。尿液标本留取结束后，腹腔注射1%水合氯醛麻醉大鼠，摘眼球取血4～5 mL，3000 r·min－1离心10 min，取上层血清。按试剂盒说明书方法测定血清中FBG、BUN 和Scr水平。取血后处死大鼠，迅速留取肾脏，生理盐水冲洗直至整个肾脏变为苍白色，在冰上操作去除肾脏被膜，切取部分肾皮质置于新配置的10%甲醛溶液固定，用于光镜组织病理学观察。其余肾组织切块置于冻存管中，放入液氮中速冻，待完全冷冻后放入－80℃冰箱中保存， 用于电镜观察及Western blotting 法检测。

1.5 各组大鼠肾脏组织病理形态学观察大鼠肾脏组织于10%甲醛溶液中固定3 d 后，将固定好的肾脏组织修整，固定、石蜡包埋、切片后进行HE染色，光镜下观察各组大鼠肾脏肾小球组织病理形态表现。

1.6 免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏足细胞中Synaptopodin 蛋白表达水平石蜡切片常规脱蜡至水、抗原修复后，切片自然冷却至室温，PBS 缓冲液冲洗后擦干组织周围的PBS 溶液，加5% BSA溶液于37 ℃温箱中孵育封闭20 min。滴加兔抗Synaptopodin 多克隆抗体（1∶1000） 4 ℃过夜，PBS 缓冲液冲洗后滴加羊抗兔IgG-HRP 二抗（1∶200）于37 ℃温箱中孵育封闭20 min。将切片从温箱中取出后滴加DBA 显色剂显色后浸泡于苏木精中染色30 s，用清水冲洗后进行梯度酒精脱水，浸泡在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各10 min。最后中性树脂封片，显微镜下观察。显色结果采用IPP6.0 系统，以Synaptopodin 蛋白阳性面积占所观察肾组织面积的百分比代表足细胞中Synaptopodin 蛋白表达水平，每张标本随机选取5 个视野，取每个标本的平均值。

1.7 电镜下观察各组大鼠肾脏组织足细胞形态表现切取冻存大鼠肾脏皮质组织约1 mm×1 mm×1 mm，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定；梯度酒精（50%、70%、80%、95%、100%和100%） 脱水，每次15 min，纯丙酮脱水2 次，每次15 min；EPON812 包埋液：丙酮（1∶1） 浸透30 min，纯包埋液浸透1 h。纯包埋液固化37 ℃条件下24 h，60 ℃条件下48 h；LKB-Ⅴ型超薄切片机切片。采用醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，采用日立H-600 型透射电镜观察并摄片。

1.8 Western blotting 法检测各组大鼠肾脏组织中Synaptopodin 和PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平切取冻存大鼠肾皮质组织约50 mg，按每20 mg 加入150～250 μL 蛋白提取液［RIPA 裂解液+100 mmol·L－1PMSF+原矾酸钠（Na3VO4）］，轻轻混匀，置于冰上。用电动组织研磨机匀浆肾脏组织，将匀浆液于4 ℃冰箱中充分裂解1 h 后离心取上清。BCA 法测定蛋白浓度，20 μg 蛋白溶液加入RIPA 和5×Loading buffer 调 定 成 相 同 体 积25 μL；进行蛋白变性；当日变性后加样，配置凝胶后，每孔等体积上样（上样量为20 μg），电泳，转膜后丽春红S 染色5 min，5%的脱脂奶粉室温封闭1 h 后，一抗孵育，4 ℃摇床震荡过夜。根据一抗种属选择二抗，室温震荡孵育1 h。洗涤后加入辣根过氧化物酶-增强化学发光液化学发光，经显影、定影、水洗、晾干后使用Image J 5.2 软件分析条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.9 统计学分析采用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠体质量和生化指标，肾组织中Synaptopodin、PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平经正态性检验均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、尿液中UACR 水平、FBG、血清中Scr 和BUN 水平造模前正常对照组、模型组和利拉鲁肽组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。给药8 周后，与正常对照组比较，模型组大鼠体质量明显降低（P＜0.05），尿液中UACR 水平、FBG、血清中Scr 和BUN 水平明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，利拉鲁肽组大鼠尿液中UACR 水平、FBG、血清中Scr 和BUN水平明显降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量、尿液中UACR 水平、FBG、血清中Scr 和BUN 水平Tab.1 Body weights, levels of UACR in urine, FBG, Scr and BUN in serum of rats in various groups (n=12，x±s）

2.2 各组大鼠肾脏组织病理形态表现HE 染色结果显示：正常对照组大鼠肾小球和肾小管大小及形态均正常；模型组大鼠肾小球体积肿大，系膜细胞和基质增多，而利拉鲁肽组大鼠肾脏组织病理改变较模型组明显减轻。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织病理形态表现（HE，×400）Fig.1 Pathomorphology of kidney tissue of rats in various groups（HE，×400）

2.3 各组大鼠肾脏组织中足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin 表达免疫组织化学染色结果显示：正常对照组大鼠肾脏组织中肾小球中有较高水平的Synaptopodin 蛋白表达。与正常对照组（26.95%±2.67%） 比较，模型组大鼠肾脏组织肾小球中Synaptopodin 蛋白表达水平（17.67%±2.04%）明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，利拉鲁肽组大鼠肾脏组织肾小球中Synaptopodin 蛋白表达水平（24.28%±2.48%） 明显升高（P＜0.05）。见 图2 和3。

图2 各组大鼠肾脏组织中Synaptopodin 蛋白表达情况（免疫组织化学，×200）Fig.2 Expressions of Synaptopodin protein in kidney tissue of rats in various groups（Immunohistochemistry, ×200）

图3 各组大鼠肾组织中Synaptopodin 蛋白表达水平Fig. 3 Expression levels of Synaptopodin protein in kidney tissue of rats in various groups

2.4 各组大鼠肾脏组织中足细胞形态表现正常对照组大鼠肾脏足突覆盖于肾小球基底膜外表面，形态正常，分布均匀；模型组大鼠肾脏足突增宽、肿胀、广泛融合，部分可见足突消失。溶酶体坏死，肾间质水肿；利拉鲁肽组大鼠肾脏足突肿胀和融合好转，与正常对照组大鼠肾脏足突结构相似。见图4。

图4 电镜观察各组大鼠肾脏组织中足细胞形态表现（×6000）Fig.4 Morphology of podocytes in kidney tissue of rats in various groups observed by electron microscope（×6000）

2.5 各组大鼠肾脏组织中Synaptopodin 和PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平与正常对照组比较，模型组大鼠肾脏组织中Synaptopodin、PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较， 利拉鲁肽组大鼠肾脏组织中Synaptopodin、PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与利拉鲁肽组比较，利拉鲁肽+LY294002 组大鼠肾脏组织中Synaptopodin、PI3K和p-Akt 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见 图5 和6。

图5 各组大鼠肾组织中Synaptopodin 和PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达电泳图Fig. 5 Electrophoregram of expressions of Synaptopodin and PI3K/Akt signaling pathwayrelated proteins in kidney tissue of rats in various groups

3 讨论

DN 是由糖代谢异常所致的慢性肾脏病，早期病理改变包括肾脏体积增大、肾小球基底膜和肾小管均有不同程度的代偿性增生等，早期功能性改变主要为肾小球高滤过、肾血浆流量和滤过分数增加，临床表现为微量白蛋白尿［8］。足细胞附着于肾小球基底膜的外侧，是肾小球滤过屏障的重要组成部分。研究［9］表明：DN 的发生发展与足细胞形态和功能的改变密切相关。大鼠DN 足细胞损伤后的主要形态学改变主要包括足细胞肥大、足突融合、足细胞脱离和足细胞凋亡［10］。抑制足细胞损伤可有效改善肾脏病理和肾脏功能性改变及蛋白尿的发生。麻黄附子参浊汤通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路的激活缓解高糖诱导的足细胞损伤［11］，可能与足细胞自噬对糖尿病模型小鼠肾小球内皮功能障碍的保护作用相关［12］。增加SIRT1 活性可以保护糖尿病诱导的足细胞损伤，并有效缓解DN 的进展［13］。与上述研究结果一致，本研究中模型组大鼠肾脏中肾小球体积肿大，系膜细胞和基质增多，足突增宽、肿胀、广泛融合，部分可见足突消失，足细胞特异性标志蛋白Synaptopodin 表达量减少。而利拉鲁肽可明显改善肾功能，减轻大鼠肾脏组织改变，使大鼠肾脏组织足细胞中Synaptopodin 蛋白表达水平明显升高。本研究结果表明：利拉鲁肽可改善DN 大鼠足细胞损伤。

GLP-1 是回肠内分泌细胞在餐后分泌的一种脑钠肽，通过调节胰岛细胞功能、食物摄取和胃肠运动来控制糖代谢。GLP-1 受体激动剂除有明确的降糖作用以外，亦会明显改善2 型糖尿病患者大血管和微血管并发症的预后［14-15］，在糖尿病大鼠和啮类动物模型中同样有明显的DN改善作用［16-17］。GLP-1被认为是一种肠-肾轴（快速作用的前馈循环，维持体内电解质和体液稳态）调节因子，其对肾脏有直接保护作用［18］。GLP-1 受体激动剂增加糖尿病患者的利钠作用并可改善糖尿病引起的肾小球高滤过的肾脏血流动力学［19］。高血糖引起全身和局部炎症、氧化应激并出现细胞增殖、纤维化，最终可影响肾脏形态及功能。炎症作用刺激增加GLP-1的分泌，GLP-1 反过来调节肾脏和血管炎症［20］。GLP-1 受体激动剂利拉鲁肽能明显抑制糖尿病大鼠血BUN、Scr 和尿白蛋白排泄率的升高，减轻肾脏肥大、系膜扩张和肾小球纤维化，减轻DN 肾小球细胞外基质（extracellular matrix，ECM） 积累和肾脏损伤［21］。利拉鲁肽可降低结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）表达，增加骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP-7） 表达，改善肾脏功能及肾脏组织病理改变［22］。这与本研究结果一致，表明利拉鲁肽对DN肾脏损伤有改善作用。

图6 各组大鼠肾组织中Synaptopodin 和PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平Fig. 6 Expression levels of Synaptopodin and PI3K/Akt signaling pathway-related proteins in kidney tissue of rats in various groups

研究［23］显示：利拉鲁肽下调核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，激活内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，改善糖尿病大鼠肾脏损伤；利拉鲁肽可增强Wnt/β-catenin 信号通路减轻肾脏损伤［21］；利拉鲁肽通过抑制高级氧化蛋白产物（advanced oxidative protein products， AOPP）、 激 活 沉 默 信 息 调 节 因 子1（silent information regulator 1，Sirt1） 和激活Akt/FoxO1 信号通路起到肾脏的保护作用［6，24］。

PI3K/Akt 是位于细胞内的重要信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K/Akt 信号通路与DN 的发生发展密切相关，该通路通过保护足细胞从而抑制DN进展。研究［25］显示：雷公藤红素通过PI3K/Akt 信号通路减轻肾脏损伤，抑制肾小球基底膜增厚，并在DN 中实现足细胞稳态。三七皂苷R1 通过激活PI3K/Akt 信 号 通 路 改 善DN 大 鼠 足 细 胞 损 伤［26］。下调白细胞介素1 受体关联激酶1 （interleukin-1 receptor-associated kinase 1， IRAK1） 可 通 过PI3K/Akt 信 号 通 路 降 低DN 足 细 胞 凋 亡［27］。本 研究结果显示：利拉鲁肽可缓解DN 肾小球病理形态学变化，可使肾脏组织中足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin 及PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平明显升高，而提前30 min 腹腔注射PI3K 抑制剂LY294002 可抑制利拉鲁肽对大鼠肾脏组织中足细胞的保护作用，使足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin 蛋白和PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达水平降低。由此可以推断，利拉鲁肽通过激活PI3K/Akt 信号通路起到足细胞保护作用。利拉鲁肽是否通过其他蛋白介导对足细胞的保护，需要进一步通过实验证实。

综上所述，在DN 大鼠模型中，利拉鲁肽对保护肾脏功能、缓解肾脏病理形态损害有确切疗效，其作用与改善足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin表达有关，其保护机制可能通过激活PI3K/Akt 信号通路而实现的。利拉鲁肽对DN 大鼠肾脏功能和足细胞损伤的改善作用为其在DN 治疗中的临床推广应用提供了有力依据。