磷酸甘油酸激酶1通过调控β-catenin表达促进胶质瘤细胞侵袭性生长

阎华，刘宇阳，陈永严，肖红，刘宏毅

胶质瘤起源于神经上皮组织，约占原发脑肿瘤的45.2%[1]，恶性脑肿瘤的80%[2]。胶质瘤侵袭性极高，在脑内沿白质纤维呈三维不规则浸润生长，甚至可在有限范围内见到多中心生长。目前国内采用的胶质瘤的主流治疗方案由Stupp教授在2005年提出，包括安全前提下最大程度地切除肿瘤，随后6周的同步放化疗及6周期的替莫唑胺(temozolomide，TMZ)辅助化疗[3]。即使如此，胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)患者的中位生存期也仅仅14.6个月[4]。

由于脑组织的特殊性限制了手术的切除范围，侵犯至周边组织的胶质瘤细胞将成为点燃复发的火种，因此探寻胶质瘤局部浸润侵袭机制，对患者治疗有着重大意义。在本研究的前期工作中，筛选出磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)可能参与了胶质瘤的恶性生物学行为，体现在高级别、易复发、放射抵抗的胶质瘤中表达明显升高[5-6]，提示在胶质瘤中PGK1可能与促进胶质瘤细胞侵袭浸润相关。为此，本研究设计了一系列实验，探寻PGK1对胶质瘤侵袭生长的影响极其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 U87细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)，胎牛血清(GIBCO)，完全培养基(HyClone)，细胞裂解液(碧云天)，PMSF(碧云天)，PVDF膜(Millipore公司)，PGK1一抗(novus，1∶1 000)，β-catenin一抗(Affinity，1∶800)，p-β-catenin(S552)一抗(Affinity，1∶1 000)，p-β-catenin(Y142)一抗(abcam，1∶500)，p-β-catenin(Y333)一抗(abcam，1∶1 000)，p-β-catenin(Y654)一抗(abcam，1∶1 000)，p-β-catenin(S675)一抗(Affinity，1∶2 000)，GADPH(杭州贤至生物有限公司，1∶1 000)，羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司，1∶100)，抗荧光淬灭剂封片液(southernbiotech公司)Human PGK1 cDNA质粒(北京义翘神州科技有限公司，HG11114-M)，BamH I及Not I(TAKARA)，Trizol试剂(Ambion公司)，martigel(BD公司)，Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen公司)，β-catenin抑制剂(XAV 939)(targetmol公司)。

1.2 PGK1，β-catenin表达情况检测 U87细胞用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。PBS(0.01 M pH 7.2～7.3)洗涤细胞，重复以上操作两次。以含PMSF的裂解液(按1 mL裂解液加10 μL PMSF)冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 rpm离心5 min。将离心后的上清分装转移到0.5 mL的离心管。将提取的蛋白上清与5×蛋白上样缓冲液放入沸水中进行沸水浴10 min，变性完后冷却至室温。将制备好的胶固定到电泳槽上，储液池中倒入电泳液。用微量加样器将制备好的蛋白样品和marker(北京全式金生物技术有限公司，DM111)加入上样孔，各样品总蛋白量为40 μg。在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳2 h，湿法转移蛋白质到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜封闭2 h。用封闭液稀释一抗，4 ℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，5 min/次。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗(1∶5 000稀释)，孵育2 h。重复洗膜过程。化学发光法检测并暗室曝光，X胶片显影。以β-actin为内参，将目的蛋白条带灰度与内参进行比较，获得比值，定量蛋白表达程度。

1.3 细胞生长、迁移及侵袭能力检测

1.3.1 CCK-8检测细胞增殖 按分组进行细胞转染和药物处理72 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培养4 h；酶标仪测定各孔吸光值光密度(optical delnsity，OD)450。

1.3.2 Transwell-martigel检测细胞侵袭 消化细胞，按2.5×104cell/mL浓度接种在含martigel的Tranwell小室上室，37 ℃，5% CO2培养箱培养12 h，按分组进行细胞转染和药物处理；转染72 h后取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用干净的棉球将上室一侧的未迁移细胞擦干净，用10%甲醇溶液固定细胞30 min；小心切下膜，在膜上滴一滴5%结晶紫染液，室温中放置20 min，PBS清洗后显微镜下观察拍照。

1.3.3 Transwell检测细胞迁移能力 消化细胞，按2.5×104cell/mL浓度接种在含不含martigel的Tranwell小室上室，37 ℃，5% CO2培养箱培养12 h，按分组进行细胞转染和药物处理；转染72 h后取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，用10%甲醇溶液固定细胞30 min；小心切下膜，在膜上滴一滴5%结晶紫染液，室温中放置20 min，PBS清洗后显微镜下观察拍照。

1.4 免疫荧光双标检测 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3 min×3次，4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3 min×3次，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min。吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加稀释好的PGK1(1∶50)并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。PBS浸洗爬片3 min× 3次，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光(FITC)标记羊抗小鼠IgG(1∶100)，湿盒中37 ℃孵育1 h，PBS浸洗切片3 min×3次，吸水纸吸干液体，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min。吸水纸吸掉封闭液，不洗，然后滴加稀释好的β-catenin(1∶200)，于4 ℃湿盒中避光孵育过夜。PBS 浸洗爬片3 min× 3次，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG(1∶100)，湿盒中37 ℃孵育1 h，PBS浸洗切片3 min× 3次，滴加 DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水纸吸干爬片上的液体，用抗荧光淬灭剂封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.5 PGK1过表达载体构建、效果验证及PGK1 siRNA合成、效果验证

1.5.1 PGK1过表达载体的建立 以NM_000291.3基因序列为模板设计引物，Human PGK1 cDNA质粒为模版扩PCR得到目的片段。用BamH I和Not I双酶切质粒pLVX-PGK-Puro和胶回收产物homo PGK1。将回收纯化的目的片段Homo PGK1与回收纯化的载体pLVX-PGK-Puro连接，连接产物命名为pLVX-PGK-Puro-homo-PGK1。连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布LB AMP平板，37 ℃温箱培养过夜。挑取单个菌落，接种于LB AMP液体培养基中，37 ℃ 250 rpm培养过夜。取相应菌液做菌落PCR，送鉴定正确菌液测序。

1.5.2 PGK1 siRNA合成及细胞转染 设计合成针对人源PGK1的siRNA序列3条及1条对照siRNA。PGK1 siRNA1-Sense(5′-CCAAGUCGGUAG-UCCUUAUTT-3′)，PGK1 siRNA1-Antisense(5′-AUA-AGGACUACCGACUUGGTT-3′)，PGK1 siRNA2-Sense(5′-GCUUCUGGGAACAAGGUUATT-3′)，PGK1 siRNA2-Antisense(5′-UAACCUUGUUCCCAGAAGCTT-3′)，PGK1 siRNA3-Sense(5′-CCUGGAAGGUAAAGUCCU-UTT-3′)，PGK1 siRNA3-Antisense(5′-AAGGACUUU-ACCUUCCAGGTT-3′),Control siRNA-Sense(5′-UUC-UCCGAACGUGUCACGUTT-3′)，Control siRNA-Antisense(5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。

取生长状态良好的U87细胞，以5×105/孔接种到六孔板中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱24 h。待细胞贴壁后，按照Lipofectamine 2000试剂盒的转染步骤准备转染试剂：一只EP管(A管)用250 μL Opti-MEM稀释5 μL Lipofectamine 2000，室温静置5 min；一只EP管(B管)用250 μL Opti-MEM(Gibco)稀释2 μL siRNA或2 μg质粒。将A、B两管的溶液轻轻混匀后，室温静置20 min；将Lipofectamine 2000混合液加入到含有1.5 mL 完全培养基的6孔板中。转染4～6 h后更换培养基，转染60 h时加入5 μM XAV 939，再培养12 h。

1.6 qRT-PCR检测 收集细胞，加入Trizol试剂，用枪吹打混匀，移至无RNase的EP管中，裂解10 min。加入200 μL氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温放置5 min。在4 ℃，12 000 rpm下离心15 min，可见分成上(RNA)/中(蛋白)/下(DNA)三相。转移上层水相于另一新EP管中，加入异丙醇，混匀后室温静置10 min。4 ℃，12 000 rpm，离心10 min，管底可见白色的RNA沉淀。弃上清，加入无RNase的75%乙醇，涡旋混匀后，4 ℃，10 000 rpm，离心5 min，重复此步骤一次。弃上清，空气中干燥RNA沉淀5～10 min，将沉淀溶于DEPC水中。取溶解后的RNA用微量分光光度计测定OD260、OD280以及OD260/OD280值，计算RNA的纯度和浓度。根据OD260/OD280比值，估测RNA质量，比值在1.8～2.0之间满足实验要求。配制逆转录反应体系，逆转录成cDNA，25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。cDNA做8倍稀释，配制实时荧光定量PCR反应体系，50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 cycles。引物由擎科生物技术公司合成：Homo PGK1-Forward(5′-ACGCCAAGACGTTCAAGCGCAGCTA-3′)，Homo PGK1-Reverse(5′-GGGGAGCGTGCCACCTTGACG-AAGC-3′)，Homo GAPDH-Forward(5′-TGCGCC-CCAGTGTTTAGACTATC-3′)，Homo GAPDH-Reverse(5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′)。

2 结 果

转染siRNA序列后对U87细胞中PGK1的表达有抑制作用，PGK1过表达载体可增加胶质瘤细胞中PGK1表达量。PGK1过表达载体测序比对达到100%，且经PCR验证显示高表达PGK1 mRNA，说明载体构建成功。设计合成的3个PGK1 siRNA转染后，均低表达PGK1 mRNA，选择干扰效果最好的PGK1 siRNA1进行后续实验(siRNA抑制PGK1表达数据统计采用单因素方差分析，过表达载体增加PGK1表达数据统计采用t检验)。见图1。

PGK1过表达载体构建成功，PGK1表达量增加，PGK1 siRNA合成成功，U87细胞中PGK1表达受到抑制； A：测序结果； B：PGK1 siRNA转染后抑制PGK1表达；**表示P<0.01 vs. Control siRNA，误差线表示SD(Blank表示U87细胞未经过任何处理，Control siRNA表示转染空白siRNA，PGK1 siRNA表示转染PGK1 siRNA)； C：PGK1过表达载体转染后高表达PGK1；**表示P<0.01 vs. Control，误差线表示SD(Control表示转染空白载体，PGK1 OE表示转染PGK1过表达载体)

PGK1表达增加可导致U87细胞活性增加，侵袭能力及迁移能力增加；PGK1表达抑制可导致U87细胞活性减弱，侵袭能力及迁移减少。PGK1可对β-catenin表达进行调控。通过前期构建的PGK1过表达载体和PGK1 siRNA进行U87细胞转染，结果显示经过PGK1 siRNA或PGK1过表达质粒转染后，U87细胞生长活性出现相应降低及增加，使用β-catenin抑制剂(XAV 939)处理细胞，细胞生长活性降低，并且可导致过表达PGK1的U87细胞生长活性下降(图2)，细胞侵袭能力和迁移细胞数也出现相应增加或减少(图3-4)。

与对照组相比，转染了siRNA的U87细胞细胞活性均下降，转染PGK1质粒高表达PGK1的U87细胞活性明显增高；进一步在高表达PGK1的U87细胞基础上，使用β-catenin抑制剂XAV 939能一定程度上降低PGK1对细胞增殖活性的影响；数据统计采用单因素方差分析，误差线表示SD；**表示P<0.01

与对照组相比，U87细胞Transwell上室细胞侵袭数统计结果(5%结晶紫染色，×200)；细胞侵袭能力随着PGK1表达量的增减出现相应增加或减少，XAV 939抑制β-catenin表达可削弱PGK1对细胞侵袭能力的影响；数据统计采用单因素方差分析，误差线表示SD；**表示P<0.01

与对照组相比，U87细胞Transwell上室细胞迁移数统计结果(5%结晶紫染色，×200)；随着PGK1表达量的增减，细胞迁移细胞数也出现相应增加或减少，β-catenin抑制剂XAV 939可削弱PGK1对U87细胞迁移能力的影响；数据统计采用单因素方差分析，误差线表示SD；**表示P<0.01

荧光双染结果显示，PGK1干扰处理后，细胞PGK1和β-catenin荧光表达均明显降低，共定位区域减少；过表达PGK1后，细胞PGK1和β-catenin荧光表达均明显增加，共定位区域增加。β-catenin抑制剂(XAV 939)对上游蛋白质PGK1荧光表达无明显影响，对β-catenin有明显的抑制作用，PGK1和β-catenin共定位区域减少(图5)。

图5 PGK1与β-catenin在U87细胞中表达的荧光双染检测

Western Blot检测显示，PGK1干扰处理后，细胞PGK1、β-catenin、p-β-catenin(S552)、p-β-catenin(Y142)、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y645)、p-β-catenin(S675)蛋白质表达均明显降低；过表达PGK1后，各蛋白质表达均明显增加。β-catenin抑制剂(XAV 939)对上游蛋白质PGK1表达无明显影响，对β-catenin、p-β-catenin(S552)、p-β-catenin(Y142)、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y645)、p-β-catenin(S675)的表达均有明显的抑制效果(图6)。

Control siRNA表示U87细胞经过空白siRNA转染72 h；PGK1 siRNA表示U87细胞经过PGK1 siRNA转染72 h；Vector NC表示U87细胞经过空白质粒转染72 h；PGK1 OE表示U87细胞经过PGK1过表达质粒转染72 h；Vector NC+XAV 939表示U87细胞经过空白质粒转染60 h后，加入5 μM β-catenin抑制剂(XAV 939)处理12 h；PGK1 OE+XAV 939表示U87细胞经过PGK1过表达质粒转染60 h后，加入5 μM β-catenin抑制剂(XAV 939)处理12 h

p-β-catenin(S675)磷酸化位点为Ser675，磷酸化后可促进β-catenin与转录因子结合，p-β-catenin(S552)磷酸化位点Ser552，p-β-catenin(Y142)磷酸化位点为Tyr142，两者参与破坏细胞间粘附及连接；p-β-catenin(Y333)磷酸化位点Tyr333，p-β-catenin(Y654)磷酸化位点位于Tyr645，两者参与质核运输，促进入核；PGK1可能不仅调控β-catenin的表达水平，并且直接参与了后者的磷酸化，这些磷酸化的活性蛋白同样可以作用于胶质瘤细胞，促进肿瘤生长、增强肿瘤侵袭及迁移能力，最终导致患者的不良预后。

3 讨 论

尽管胶质母细胞瘤在人群中发病率仅为3.2/10万人[2]，但由于肿瘤恶性度极高，且各种方案的治疗效果一般，导致胶质母细胞瘤仍然是目前治疗难度最大的恶性肿瘤。因为肿瘤导致的高致残率及高病死率，不仅威胁患者生命安全，对个人和家庭造成严重的伤害，带来的社会经济负担更是不可估量。

长久以来，研究人员不断探索，各种新兴治疗手段如靶向治疗、免疫治疗和肿瘤电场治疗等均涉猎胶质瘤治疗领域，然而患者的生存期延长有限。因此，从胶质细胞瘤的发生机制、生长过程及环境、对不同治疗方式的敏感性等方面寻找突破点显得尤为迫切。

以前期研究为基础，本研究进一步探讨了PGK1在胶质瘤中的作用。PGK1最广为人知的身份是糖酵解过程的关键酶，其存在对生物体代谢具有极重要的意义。但在越来越多的研究中，揭示了PGK1不仅是一种代谢相关酶，与肿瘤的发生发展也密切相关。有观点认为，糖酵解途径可以为肿瘤增殖提供合成大分子所需的底物，即碳源。Hu等[7]指出在肝癌细胞中，PGK1对肿瘤细胞增殖及成瘤能力有重要影响， PGK1的异常上调表达广泛存在于胃癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌等多种高侵袭性肿瘤，被视作不良转归的标志[8-11]，但在癌周组织中的含量则接近正常，提示这种异常表达具有一定的肿瘤特异性。在这些非中枢系统肿瘤中，PGK1参与的病理生理过程涉及细胞代谢、基因转录及影响肿瘤细胞微环境等各个方面。

本研究结果提示PGK1的表达水平与胶质瘤的侵袭能力相关，并且可能激活β-catenin的表达。β-catenin通过介导基因转录过程，可以影响肿瘤细胞增殖、侵袭及转移等行为[12-14]，下游靶点可能有趋化因子受体4(CXCR4)、转录因子4(TCF4)等[15-18]，通过影响肿瘤新生血管形成及改变细胞粘附能力，促进肿瘤细胞经血液广泛转移[19]。一方面β-catenin表达活跃可促进肿瘤转移、浸润生长等恶性进程[20-23]，另一方面当β-catenin活性被抑制时，肿瘤的生长将被削弱[24]。本研究结果证实了在胶质瘤中PGK1可能通过影响β-catenin的作用，促进肿瘤生长及侵袭过程，但其中的具体机制目前尚不十分明确。但本研究发现β-catenin的几种磷酸化形式：p-β-catenin(S552)、p-β-catenin(Y142)、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y645)、p-β-catenin(S675)均出现了与PGK1表达同向的变化，β-catenin的磷酸化是其重要的活化形式，提示或许PGK1通过对β-catenin的磷酸化来完成调控过程。根据磷酸化位点的不同，β-catenin参与了与转录因子的结合(S675)，破坏细胞间粘附及连接(S552及Y142)，质核运输，促进入核(Y333及Y645)等过程。这些作用对于肿瘤细胞的增殖、侵袭至关重要。深入研究PGK1对β-catenin的调控机制将是今后的重要探索方向。

综上所述，PGK1的过表达对胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移均有促进作用，其机制可能与调控β-catenin表达及对后者的磷酸化相关。在2016新版WHO中枢神经系统肿瘤分类中，将分子分型对肿瘤的诊断提升到了非常重要的位置，为科研、临床及肿瘤流行病学提供了确实的指导，同时显示出今后肿瘤学中，分子标志物必将有广阔而光明的应用前景。进一步求证PGK1在胶质瘤中的未解之谜，评估其作为分子标志物的可能性，或许终有一日，可为胶质瘤的多元化、个性化治疗方案提供选择。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。