MALAT1介导β-catenin通路参与Salvinorin A减轻脑卒中后血脑屏障损伤的机制

马晓晓，董海平，周薇，忻纪华，王震虹

脑卒中是世界范围内人类死亡和残疾的主要原因，是仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。根据最新发布的《2016年脑卒中流行病学报告》显示，脑卒中已成为中国居民第一致残原因。在所有脑卒中病例中，高达86%是缺血性脑卒中[1]。众所周知，在缺血性脑卒中期间血液供应受损后出现的低氧和低葡萄糖等状态，导致血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏，形成血管源性水肿并发生出血转化[2]，后续出现神经元损伤[3]。因此，BBB的保护已成为预防缺血性脑卒中脑血管功能障碍的重要治疗策略。

κ阿片受体(kappa opioid receptor，KOR)在人类和动物的大脑组织中分布广泛，不仅在脑皮质和海马纹状体等部位表达丰富[4]，在脑血管内皮中也高水平地表达并发挥重要的生物学功能[5]。近期研究表明，KOR激动剂可以有效地减轻脑缺血再灌注后的神经损伤和脑水肿[6]，保护BBB的功能[7]。丹酚A(salvinorin A，SA)作为一种短效的高选择性KOR激动剂，可以容易地通过BBB，安全性高，对于脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)机制的研究具有独特的优势[6]。脑血管内皮细胞作为BBB最基本的组成结构，其在IRI中起到了关键性作用，内皮细胞功能改善是IRI后BBB稳定的基石。因此，本研究将针对脑血管内皮细胞参与SA对IRI后的脑保护和BBB改善的机制进行阐明。

现有的研究表明，非编码RNA(noncoding RNAs，NcRNAs)，包括长链非编码RNAs(long noncoding RNAs，LncRNAs)、环状RNAs(circular RNAs，CircRNAs)和微RNAs(mini RNAS,MiRNAs)均参与了IRI的病理发展，可作为生物标志物、治疗靶点或预后指标[8]。LncRNA-MALAT1是最近才被研究发现在内皮细胞上发挥重要作用的LcnRNA，其作用和内皮细胞的生长、炎症和增殖以及细胞紧密连接均有关系[9]。研究表明，MALAT1在缺血刺激后明显增加，并参与血管内皮细胞损伤和脑微血管完整性的调控[10-11]。MALAT1定位于细胞核参与mRNA 前体可变剪切，对mRNAs具有调节吸附功能，进而发挥其下游功能。β-catenin信号通路是中枢神经系统血管形成、BBB形成的基础[12-13]。最近有研究表明，内皮细胞β-catenin信号对于维持成熟BBB的完整性是必需的，并且在脑卒中患者中可检测到β-catenin水平的降低和连接蛋白claudin-1的缺失[14]。

因此，本研究采用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型和脑血管内皮细胞糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型阐明了SA在缺血再灌注导致的BBB损伤中的保护作用，并探讨SA通过促进内皮细胞中MALAT1表达，进而调控β-catenin的表达从而减轻内皮细胞损伤，改善BBB功能的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雄性SD大鼠(180～200 g)，购自上海交通大学实验动物中心[SYXK(沪)2018-0028]。人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMECs)，购自美国ScienCell。主要实验药物、试剂与仪器：SA(Sigma，美国)；NB(Sigma，美国)；伊文思蓝试剂(Evans Blue,EB,Sigma-Aldrich, 美国)；Cell counting kit-8(Dojindo， 日本)；一抗ZO-1 、occludin (Proteintech，美国)，一抗claudin-5、β-catenin、actin (Abcam，英国)；二抗和DAPI(ZSGB-Bio，中国)；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒(Yeasen，美国)；siRNA 质粒(武汉枢密脑科学技术有限公司，中国)；大鼠线栓(北京西浓科技有限公司)；化学天平(BS110S, Sartourius，德国)；二氧化碳培养箱、细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；荧光显微镜(Ti2E，尼康，日本)。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型制作 在本研究中，使用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)大鼠腹腔注射麻醉后，分离大鼠右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)。将圆形尖的单丝尼龙线栓经ECA残端插入ICA，放置线栓后将颈总动脉的丝线结扎固定，阻断大脑中动脉起点90 min后恢复血流灌注。整个手术过程中使用加热毯和加热灯将直肠温度维持在(37.0±0.8)℃。24 h后参照Bederson 评分评估大鼠脑梗死后神经功能障碍。

1.2.2 动物分组及处理 实验动物分成4组(每组15只)，随机分组如下：SH组(假手术组)；MCAO组(大鼠中动脉栓塞组)；SA组(salvinorin A组+MCAO组)；NB组(KOR拮抗剂组+SA+MCAO组)。SH组大鼠进行颈部切口及血管分离操作，不放置线栓。MCAO组采用线栓阻断一侧颈内中动脉90 min后拔除线栓恢复血流再灌注。SA组为进行MCAO操作过程中于线栓置入后即刻经尾静脉注射SA(20 μg/kg)。NB组为SA前30 min使用KOR拮抗剂norbinaltorphimine (NB,4 mg/kg，尾静脉注射)，其余同SA组操作。根据本研究以往文献中使用的有效剂量选择本次药物剂量[15]。

1.2.3 运动神经功能检测 大鼠在MCAO术后1、2、5 d，用改良大鼠神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS)测定大鼠的神经功能状况。如前所述[16]，mNSS被认为是大鼠运动、反射、感觉和平衡的评价标准。主要行为终点为神经综合评分(1～6分：轻度损伤；7～12分：中度损伤；13～18分：严重损伤)。

1.2.4 脑水肿检测 采用干湿法测定大鼠MCAO后24 h的脑含水量(brain water content，BWC)以便量化脑水肿。取大鼠缺血脑半球，采用化学天平测定湿重，然后放入烤箱中烘烤(110 ℃，24 h)得到干重。通过下列公式：脑水增益%=(湿重-干重)/湿重×100%计算得出BWC值。

1.2.5 BBB通透性检测 使用伊文思蓝试剂(Evans Blue,EB)测量BBB的完整性。MCAO后24 h，大鼠尾静脉注射2% EB(4 mL/kg)，循环2 h后，用0.9% NaCl经口灌注至右心房流出液清晰。然后分离脑梗侧脑半球，称重，并在37 ℃水浴的甲酰胺溶液中孵育。48 h后，1 000 g离心15 min，分离上清。最后，用分光光度计在632 nm波长对样品进行检测，并测量EB渗出量。

1.2.6 细胞培养和分组 在100 mm培养皿中按照106个/孔的密度，将细胞置于含10%胎牛血清(fetal calf serum，FBS)、1%青霉素和链霉素溶液的RPMI 1640培养基中培养，置于加湿培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养。siRNA转染细胞：将细胞按50%的融合度接种到24孔板，加入培养基DMEM+10%FBS。按照说明将siRNA-转染试剂混合液加入含有细胞及原培养液(约含400 μL)的孔中，在37 ℃的CO2培养箱中培养。6 h后将培养基换为含血清的完全培养基。将HBMECs随机分为5组： 空白对照组(Blank组)、糖氧剥夺组(OGD组)、SA组(SA+OGD组)、M组(MALAT1 siRNA+OGD组)、SA+M组(SA+MALAT1 siRNA+OGD组)。SA组为OGD复氧即刻细胞培养中加入SA(2 uM)， M组为MALAT1特异性小干扰RNA(siRNA，100 nM)转染细胞48 h后进行OGD处理，SA+M组中细胞转染同M组处理，OGD复氧即可加入SA。

1.2.7 OGD模型 弃去细胞完全培养液，以D-Hank’s冲洗细胞两遍，换 Kreb’s 溶液(NaCl 119 mmol/L、KCl 4.7 mmol/ L、KH2PO41. 2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、 CaCl22.5 mmol/L、MgCl21 mmol/L)；置于37 ℃、85% N2+5% CO2+0.02%～0.2% O2密闭缺氧箱中培养6 h，之后更换培养基为完全培养液，并进行 5% CO2+ 95% 空气通气复氧24 h。

1.2.8 细胞活性及凋亡检测 使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞相对活性，96孔板中每孔按4×103个细胞的密度接种细胞(每组设置2个复孔)，待细胞贴壁后继续在细胞培养箱中培养24 h；进行OGD模型处理，复氧24 h；每孔中加入新鲜配制的含 10 μL的毒性检测液CCK-8，并置于培养箱中继续培养4 h ；使用酶标仪测波长为450 nm的光密度(optical density,OD)值，按公式计算细胞相对活性=[(对照组OD-实验组OD)/对照组 OD] ×100%。使用流式细胞术检测细胞凋亡率(AnnexinV-FITC/PI双染法)：收集细胞，用预冷的1×PBS洗涤细胞2次，2 000 rpm、4 ℃离心5 min，收集沉淀细胞并重悬；加入500 μL的1×Binding Buffer重悬浮细胞；Annexin V-FITC标记：加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min；PI标记：上机前5 min加入5 μL Propidium Iodide，混匀，室温、避光；上机前，加入200 μL 1×Binding Buffer，进行流式细胞检测；用流式细胞仪检测：Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，激发波长Ex=为488 nm，发射波长Em=525 nm；PI的红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检测，建议使用FL3，激发波长Ex=535 nm，发射波长Em=615 nm。此外，应使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为Blank组进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

1.2.9 免疫荧光检测 制备细胞爬片，用4%多聚甲醛固定细胞，使用含有0.1% Triton X-100和5%山羊血清的PBS封闭1 h，然后用一抗ZO-1(1∶50), occludin(1∶50)和claudin-5(1∶100)于4 ℃冰箱孵育过夜。0.3% PBST溶液洗片3次，加入与FITC结合的二抗(1∶100)避光室温孵育细胞1 h。0.3% PBST溶液洗片3次，用含DAPI的封片剂封片。使用荧光显微镜拍摄荧光图像。

1.2.10 内皮细胞通透性 用Transwell检测内皮细胞通透性，每个迁移小室加入100 μL培养基含1×105个细胞，下室孔中加入600 μL培养基，24 h后分组造模处理，造模处理完成后每个迁移小室加入10 μL FITC-BSA(1 mg/mL)，继续培养2 h，取100 μL下室孔中的培养基，用荧光分光光度计485/525 nm检测FITC-BSA漏过情况。

1.2.11 蛋白质印迹(Western Blot)分析 收集细胞样本，裂解液裂解后使用BCA法测定样品蛋白浓度，蛋白变性后可置于-20 ℃冰箱保存。根据目的蛋白分子量大小选用合适浓度的蛋白电泳胶，进行蛋白电泳，转膜结束后室温封闭1 h。分别使用相应一抗(β-catenin、actin：1∶1 000)孵育，放入4 ℃摇床孵育过夜。二抗孵育后(1∶5 000)用ECL显影液显影，用Bio-Rad ChemidocXRS+成像系统记录显影结果。使用Image J软件读取条带灰度值，计算并比较目的蛋白表达变化。

1.2.12 实时荧光定量PCR分析 设计MALAT1引物(LcnRNA MALAT1-hF GCTCTGTGGTGTGGG-ATTGA； LcnRNA MALAT1-hR GTGGCAAAATGG-CGGACTTT)构建MALAT1 siRNA，细胞转染48 h后进行定量PCR检测，以评估不同siRNA的效率。根据试剂盒说明，使用Trizol试剂提取细胞总RNA，检测浓度。取500 ng总RNA作为模板，用cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA。用去离子水将cDNA溶液稀释至浓度为100 ng/μL，按照试剂盒说明操作，根据反应的CT值，计算并统计数据。

2 结 果

2.1 各组脑水肿和BBB通透性比较 干湿法结果显示，MCAO组脑水含量增加明显高于SH组(P<0.01)；SA组脑水含量增加明显低于MCAO组(P<0.05)；而NB组脑水含量增加明显高于SH组和SA组(P<0.05)。EB结果显示，MCAO组EB渗出明显高于SH组(P<0.01)；SA组EB渗出高于SH组(P<0.05)但明显低于MCAO组(P<0.05)； NB组EB渗出量较SH和SA组明显增加(P<0.05)。见图1。

2.2 各组运动神经功能比较 MCAO术后1、2、5 d的mNSS评分结果显示MCAO组的运动神经功能分值明显高于SH组(P<0.05)；SA组运动神经功能分值较M组显著下降(P<0.05)； NB组的运动神经功能分值与SH和SA组相比明显增加(P<0.05)。见图2。

2.3 各组内皮细胞的存活率、凋亡和通透性比较 CCK-8和流式细胞检测结果显示，与Blank组相比，OGD后细胞活性显著降低，而细胞凋亡率显著上升(P<0.01)；与OGD组相比，SA组中细胞相对活性明显增加，细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。见图3A、B。细胞通透性结果显示，与Blank组相比，OGD组细胞通透性明显增加(P<0.01)；与OGD组相比，SA组细胞通透性明显降低(P<0.01)。见图3C。

A：各组细胞存活率的比较； B：各组细胞凋亡的比较； C：各组细胞通透性的比较。与Blank组比较：*P<0.05，**P<0.01；与OGD组比较：#P<0.05，##P<0.01；与SA组比较:&P<0.05，&&P<0.01；N=5 (只/组)

2.4 各组内皮细胞连接蛋白和β-catenin的表达比较 免疫荧光结果显示，与Blank组相比，OGD组内皮细胞中连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表达水平明显降低(P<0.05)；与OGD组相比，SA组内皮细胞中连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表达水平明显增加(P<0.05)。见图4A。Western Blot结果显示， 与Blank组相比，OGD组内皮细胞中β-catenin的表达水平明显降低(P<0.01)；与OGD组相比，SA组内皮细胞中β-catenin的表达水平明显升高(P<0.01)。见图4B。

2.5 MALAT1干扰对各组内皮细胞的影响 RT-PCR结果可见MALAT1的RNA干扰效率。见图5A。与Blank组相比，OGD组HBMECs 内MALAT1的表达明显降低(P<0.05)；与OGD组相比，SA组HBMECs内MALAT1的表达可明显增加(P<0.01)。见图5B。而MALAT1干扰后可见，与SA组相比，SA+M组的内皮细胞活性明显降低，内皮细胞的凋亡和细胞通透性明显增加(P<0.05)。见图3A、B、C。免疫荧光和Western Blot结果显示，MALAT1被干扰后，与SA组相比，SA+M组中β-catenin和连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表达水平也发生了明显的降低(P<0.05)。 见图4A、B。

A：各组内皮细胞连接蛋白occludin，claudin，ZO-1表达的比较(红色：occluding,claudin5,ZO-1染色；蓝色：DAPI染色；×20)； B：各组内皮细胞β-catenin表达的比较。与Blank组比较：*P<0.05，**P<0.01；与OGD组比较：#P<0.05，##P<0.01

A：MALAT1的RNA干扰效率； B：各组内皮细胞MALAT1表达的比较。与Blank组比较：*P<0.05，**P<0.01；与OGD组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨 论

缺血性脑卒中发生后，脑血流的中断导致相应区域的脑血管结构和功能最早遭受到损害，造成缺血区血供障碍，物质交换异常甚至诱发脑水肿等严重病理损害，最终神经细胞损伤，导致患者死亡或严重残疾。脑血管是BBB的主要结构，其中由神经元、血管内皮细胞、胶质细胞以及周细胞和血管平滑肌细胞等组成的脑神经血管单元(neurovascular unit，NVU)，是BBB的基本结构[17]。目前为止，尚且缺乏对于IRI诱导BBB结构和功能障碍的有效预防和治疗措施。内皮细胞构成了NVU最内侧的一层，是维持BBB功能完整，调节脑血管功能和新生等的关键结构[18-20]。有研究证实，脑卒中后内皮细胞的连接蛋白破坏可导致BBB通透性的改变[21]。因此，保护脑血管内皮细胞已成为减轻脑卒中后BBB破坏的关键。因此，本研究使用在体和离体IRI模型进行SA对脑缺血再灌注后脑血管内皮的保护及机制的相关研究。

研究表明高选择KOR激动剂对于IRI具有脑保护作用，本研究结果同样证实SA可以减轻缺血再灌注后的脑损伤和运动神经功能障碍。而有研究表明KOR激动剂的脑保护与抑制脑缺血区神经元的凋亡和保护脑血管的完整性有关[6, 22-23]，但其对BBB的具体保护机制尚不明确。因此，首先本研究在大鼠MCAO模型上通过Evans Blue明确了SA对BBB损伤的保护作用，结果表明SA能有效减轻MCAO导致的BBB通透性增加。脑血管内皮细胞作为在脑缺血刺激时最先受到损伤的细胞之一，与IRI相关的细胞凋亡、细胞代谢等过程的调控机制值得更多的研究关注。对此，本研究进一步使用HMEBC的OGD模型探讨了SA对BBB的保护作用是否与内皮细胞有关。结果表明，SA可明显减轻OGD引起的内皮细胞凋亡和通透性增加，起到内皮细胞保护作用。有研究表明，内皮细胞内β-catenin的激活可转录控制粘附蛋白Claudin的表达，并对维持BBB功能的完整性具有重要作用[14]。β-catenin作为一种多功能蛋白，既是一种粘附蛋白可以将粘附蛋白粘附到细胞骨架，也是Wnt信号通路中心的转录因子[24-25]。在内皮细胞中，连接蛋白不仅起到封闭细胞间隙的作用，同时也是可对多种外部刺激和病理条件做出快速反应的结构[26-27]。内皮细胞中的连接蛋白对于血管微环境的改变更敏感，其结构的改变可导致内皮屏障破坏[28]，并且连接蛋白地表达可受到Wnt/β-catenin通路的调控[29]。因此，为明确内皮细胞β-catenin和连接蛋白在SA对内皮细胞的保护作用中的变化，本研究使用免疫荧光和Western Blot对此进行了分析。结果显示，SA可明显促进OGD后内皮细胞中β-catenin和连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表达。基于以上研究结果，本研究推测SA可通过促进β-catenin的表达发挥缺血再灌注后对内皮细胞的保护作用。

已知MALAT1可参与调节内皮细胞功能和血管生长[30]。正常状态下，MALAT1对内皮细胞的影响不明显，但内皮细胞受到外界刺激时，MALAT1是早期(缺血后数小时即可明显增高)发生改变最明显的LcnRNA之一，起到了调控内皮细胞功能的作用。在脑血管内皮细胞中的研究表明，当出现缺血缺氧时诱发MALAT1大量表达，可以明显抑制细胞的凋亡发生[31]。而在体外血管内皮细胞进行OGD处理后，MALAT1可通过调节相应mRNA的吸附来促进缺血缺氧后细胞自噬以及提高细胞的存活[32]。本研究发现，OGD后HMEBCs中MALAT1的表达明显下调，而SA的暴露可以明显上调OGD后内皮细胞中MALAT1的表达。因此，本研究进一步通过siRNA技术干扰MALAT1在HBMEC中的表达，探讨MALAT1在SA的内皮细胞保护作用中的作用机制。本研究结果表明，MALAT1表达被干扰后，SA对HMEBCs的保护作用被拮抗，即细胞活性降低，内皮细胞的凋亡和细胞通透性增加。同时，SA对于OGD后HMEBCs中β-catenin和连接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表达促进作用被抑制。因此，明确了SA对OGD后内皮细胞的保护作用与调控MALAT1表达有关。

综上所述，本研究结果提示SA可能通过调控内皮细胞中LncRNA-MALAT1表达，促进β-catenin的表达来减轻内皮细胞损伤，进而减轻脑缺血再灌注后的BBB损伤，起到脑保护作用。但是本研究尚且有一定的局限性，比如，虽然本研究在离体细胞实验中证明SA可通过上调MALAT1促进β-catenin的表达来发挥内皮细胞保护作用，然而，由于信号通路的复杂性，对于该通路在动物体内是否与其他信号通路交互作用，需要进一步的实验证明。但本研究仍为缺血再灌注后内皮细胞保护减轻BBB损伤的研究提供了新的理论基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。