IDH野生型胶质母细胞瘤患者预后影响因素分析

许广智，张佳乐，伊西才，魏礼洲，刘卫平

2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类第四版修订版，对于胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)的分类方法进行了革新，将GBM分为异柠檬酸脱氢酶1(isocitric dehydrogenase，IDH1)突变型，IDH1野生型及IDH1未检测型[1]。经过五年的完善，2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类第五版中，制订了新的分类标准，取消了GBM的IDH突变型，将传统的WHO Ⅳ级成人GBM分类改为成人型弥漫性胶质瘤，并且将其细分为IDH突变型的星形细胞瘤，IDH突变和1p/19q杂合性缺失的少突胶质细胞瘤，以及IDH野生型的GBM[2]。WHO Ⅳ级胶质瘤是中枢系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有极高的异质性，生存期短，复发率高，且易侵袭，多浸润性增长，与周围正常脑组织分界不清，是胶质瘤中恶性程度最高的肿瘤。其首发临床症状多以占位效应、颅内高压以及癫痫为主，部分研究表明具有癫痫为首发症状的预后较好[3]。目前标准治疗方案为最大程度的肿瘤切除术以及术后放化疗。接受标准治疗的患者，自初次诊断起的平均生存期为13.5个月，5年生存率不足5%[4-5]。年龄，切除程度，是否接受标准化治疗都是总生存期(overall survival,OS)的临床特征保护因素[6]。除了临床特征以外，部分组织学及基因学标志物表达也与患者的生存期相密切关。本研究通过分子诊断技术，对2017年1月—2019年12月西京医院神经外科收治的97例WHO Ⅳ级IDH野生型GBM患者进行预后分析。评估临床特征及O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)，ATRX，P53,Ki-67蛋白表达及1p/19q杂合性缺失对诊断、预后和治疗的影响，并且将IDH野生型的GBM与5例WHO Ⅳ级IDH突变型成人弥漫性胶质瘤进行比较，对在新的WHO中枢神经系统肿瘤分类后的IDH野生型GBM进行预后分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 共纳入102例WHO Ⅳ级胶质瘤患者，其中男61例，女41例；年龄20～79岁，平均年龄51.28岁；IDH野生型GBM共97例，IDH突变型星形细胞瘤4例，IDH突变并且1p/19q杂合性缺失少突胶质细胞瘤1例。纳入标准：(1)所有患者首次因胶质瘤入院并且未接受其他治疗；(2)所选病例由西京医院病理科专家诊断为WHO Ⅳ级胶质瘤；(3)患者临床资料及随访完整；(4)肿瘤病理标本符合检测要求，并具有完整的分子标志物数据；(5)术前无严重的心肝肾等系统异常；(6)所有患者对分子检测知情同意，并签署知情同意书；(7)所有患者均行全麻下肿瘤全切术。

1.2 免疫组化方法及表达的判定方法 术中取出的肿瘤组织置于4 ℃中新鲜冻存并送病理保存，之后用20%缓冲福尔马林固定包埋在石蜡中，并使用SP法进行免疫组化检测，使用MGMT单克隆抗体(福州迈新公司，即用型)，P53单克隆抗体(福州迈新公司，即用型)，ATRX单克隆抗体(福州迈新公司，即用型)，IDH突变使用sanger测序法进行检测。1p/19q杂合性缺失采用Fish法，使用奥林巴斯荧光显微镜观察分析。所有组化结果高表达指标判定方法：每个切片选择5个高倍(×400)视野，阳性率细胞大于10%判定为阳性，其中Ki-67阳性细胞率大于20%为阳性，P53弥漫阳性视为突变型(图1)。

A：ATRX阳性； B：Ki-67阳性； C：MGMT阳性； D：P53弥漫阳性

1.3 切除程度评价及随访方法 通过手术记录，术后影像学资料来判定切除程度。通过电话随访的方式对患者进行出院后随访。术后生存期定义为手术日至患者因GBM死亡或随访截止时间。平均随访日期为18.2个月。

1.4 统计学方法 使用SPSS 23.0软件对数据进行分析。通过Kaplan-Meier法以生存时间制作生存曲线进行单因素分析，通过Log-rank检验进行组间生存率比较。对单因素分析有意义的因素用COX比例风险回归模型验证危险因素及风险比率(hazard ratio，HR)，并且引入检验水准为0.05，剔除检验水准定为0.1。所有检测均为双侧检测并且α为0.05。成人弥漫性胶质瘤中IDH突变及IDH未突变型的比较，首先检验数据的正态性，由于不符合正态分布，因此以中位数(25%分位数，75%分位数)描述，比较采用Wilcoxon秩和检验。

2 结 果

2.1 临床特征 本研究中，年龄大于55岁的患者48例(47.0%)；性别比例为男∶女=61∶41；术前卡氏功能状态评分标准(Karnofsky performance status，KPS)评分>70分的78例(76.4%)；术中完全切除肿瘤的为50例(49%)；术后接受同步放化疗的为57例(55.9%)，仅接受化疗的为7例(7.0%),仅接受放疗的为1例(1.0%)，接受放化疗但并未进行同步放化疗的为1例(1.0%)，未接受放化疗的为36例(35.0%)。截止2021年10月28日因胶质瘤而死亡的89例(87.2%)，平均生存期为19.7(95%CI16.9～22.5)个月，中位生存期为15.5(95%CI13.0～18.0)个月。见表1。

表1 102例WHO Ⅳ级胶质瘤患者临床特征

2.2 术后单因素分析结果 患者年龄，KPS评分，肿瘤是否全切，是否接受同步放化疗治疗，以及MGMT蛋白表达对生存期有影响(P<0.05)。患者的性别，ATRX表达，P53突变型表达，1p/19q杂合性缺失对生存期无统计学影响(P>0.05)。见表2。

表2 97例WHO Ⅳ级IDH野生型GBM患者单因素生存分析

2.3 术后多因素分析结果 用COX比例风险模型进行多因素分析显示，患者的年龄、术前KPS评分、肿瘤切除程度、是否接受同步放化疗治疗、MGMT蛋白表达，是生存期的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 97例WHO Ⅳ级IDH野生型GBM患者多因素生存分析结果

2.4 WHO Ⅳ级成人弥漫性胶质瘤生存期差别 本研究的IDH野生型成人弥漫性胶质瘤中位生存时间为14.53(8.36～23.1)个月，而IDH突变型成人弥漫性胶质瘤中位生存时间为33.00(21.85～50.23)个月。两组都为原发性WHO Ⅳ级成人弥漫性胶质瘤。由于样本不满足正态分布，因此使用秩和检验可知两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

2021年第五版WHO中枢神经系统肿瘤分类发布后，对于神经系统的研究进入了一个新的阶段。之前国内外对于胶质瘤预后因素分析的研究中，未将WHO Ⅳ级的成人弥漫性胶质瘤中的IDH突变型星形细胞瘤和IDH突变型及1p/19q杂合性缺失少突细胞瘤与IDH野生型GBM区分开。而本研究中，除了通过单因素多因素分析，探讨了WHO Ⅳ级IDH野生型GBM相关的预后因素，还研究WHO Ⅳ级成人弥漫性胶质瘤中的IDH野生型GBM与其他两型的预后区别。本研究通过对97例IDH野生型GBM进行单因素及多因素分析，可知在IDH野生型GBM中，术前KPS评分，患者年龄，肿瘤切除程度，是否接受同步放化疗都是独立的影响因素，这个结果与WHO Ⅳ级胶质瘤的临床因素中与预后相关的独立影响因素相似[7]。分子标志物中，MGMT蛋白表达是WHO Ⅳ级IDH野生型GBM的独立影响因素(P<0.05)。既往研究中，MGMT蛋白的低表达是WHO Ⅳ级胶质瘤预后中的独立保护因素[6]；本研究进一步发现，MGMT蛋白低表达在WHO Ⅳ级IDH野生型胶质瘤中是独立的保护因素。

IDH是三羧酸循环的重要组成部分，其在WHO Ⅳ级胶质瘤中突变率为12%，在继发性WHO Ⅳ级胶质瘤中突变率为73%，在原发性WHO Ⅳ级胶质瘤中，其突变率仅为3.7%[8-9]。但继发性WHO Ⅳ胶质瘤中的高IDH发生率也表明，具有IDH突变的低级别胶质瘤常发生恶性转化为高级别胶质瘤。具有IDH1/2突变的WHO Ⅳ级胶质瘤患者预后明显好于IDH野生型的GBM患者，既往文献表明，具有IDH1/2突变的WHO Ⅳ级胶质瘤患者中位OS为31个月，而IDH野生型GBM患者，其中位生存期为15个月[10]。2021年新修订的WHO中枢神经系统肿瘤分类第五版，进一步将2016版WHO中枢神经系统肿瘤分类中的WHO Ⅳ级成人GBM(旧版)分类进行细分，将IDH突变型GBM删除，保留IDH野生型GBM，但将IDH突变型的成人WHO Ⅳ级胶质瘤分类为IDH突变型星形细胞瘤，将IDH突变并伴有1p/19q杂合性缺失的成人WHO Ⅳ级胶质瘤分类为IDH及1p/19q杂合性缺失的少突胶质瘤，可见IDH突变不仅是胶质瘤预后标志物，也是WHO Ⅳ级胶质瘤的分类标志物。本研究中通过对比WHO Ⅳ级IDH野生型GBM及IDH突变型WHO Ⅳ级成人弥漫性胶质瘤，发现IDH野生型GBM患者生存期更短[2]，因此术后常规进行IDH基因检测，除了可以更好地对WHO Ⅳ级胶质瘤进行分类，还可以更好地预测患者的预后。

MGMT基因是胶质瘤最重要的甲基化标志物。MGMT编码的DNA修复蛋白可以将鸟嘌呤O6位置的烷基基团清除，但当DNA修复消耗的MGMT蛋白不足时，会导致未修复的DNA受到损伤。MGMT启动子甲基化可使MGMT蛋白表达受到抑制，可能加强DNA对烷基化试剂(替莫唑胺)的敏感性。并且胶质瘤一些位点的基因启动子甲基化，会导致某些抑癌基因的表达水平改变[11]。同时，对于具有IDH1突变和MGMT启动子甲基化的WHO Ⅳ级胶质瘤，替莫唑胺的疗效更好[12]。虽然有多项研究证实MGMT启动子甲基化与MGMT蛋白的表达呈负相关，但MGMT启动子甲基化与MGMT蛋白表达并不完全一致[13]。MGMT蛋白在旧的分类的WHO Ⅳ级GBM中，作为一种单独预后标志的作用已被证实，并被广泛运用于胶质瘤的分子标志物检查中[6]。本研究中，MGMT启动子甲基化在WHOⅣ级IDH野生型GBM中的单因素及多因素分析中有统计学意义(P<0.05)，且MGMT蛋白的低表达为保护因素，因此应当积极地对进行了肿瘤全切术的IDH野生型GBM患者进行术后常规MGMT启动子甲基化或者蛋白表达量检测，可以更好地对患者术后生存时间进行预测。

ATRX蛋白表达、P53突变型表达、Ki-67表达在其他类型的肿瘤中有发现与预后相关[14-17]，但既往文献中没有报道这三种分子的蛋白表达对于WHO Ⅳ级IDH野生型GBM的预后是否相关，因此本研究将这三种分子标志物纳入分析因素中，并证实这三种分子标志物与IDH野生型GBM预后不相关。 其中ATRX基因是地中海贫血/精神发育迟滞综合征的致病基因，位于X染色体，其基因突变导致的ATRX蛋白缺失，与端粒替代延长机制(alternative lengthening of telomeres,ALT)密切相关[14]。约80%的原发性和7%的继发性WHO Ⅳ级胶质瘤会具有ATRX突变，并且通常伴随有IDH突变[7]。在WHO Ⅲ级胶质瘤中，具有ATRX缺失的间变性胶质瘤预后明显好于没有ATRX缺失的间变性胶质瘤[14]，在WHO Ⅳ级IDH野生型GBM中，ATRX突变仅占很少的部分(3%)，但有研究表明虽然在IDH突变型WHO Ⅳ级成人弥漫性胶质瘤中ATRX与预后不相关，但在WHO Ⅳ级IDH野生型成人弥漫性胶质瘤中，ATRX突变型与ATRX野生型相比，其生存率增加[18]。P53基因包括突变型和野生型，其中野生型为抑癌基因。突变型在免疫组化上呈高表达并且与肿瘤恶性程度呈正相关[19]。P53主要通过改变参与细胞周期、凋亡和细胞衰老的众多基因的表达来发挥作用[20]。虽然在其他类型肿瘤中已经发现P53突变与预后相关[15]，但P53突变与WHO Ⅳ级胶质瘤预后的相关性仍存在争议[21]。Ki-67是一种非组蛋白，在增殖细胞的整个细胞周期中表达，但在静止细胞(G0)中不表达，被用于区分生长细胞和非生长细胞[22]。有荟萃分析报道，Ki-67的高表达与低生存期相关[16]。1p/19q杂合性缺失，即染色体1短臂和染色体19长臂的共同缺失，导致染色体臂着丝粒移位。其中，1p/19q杂合性缺失及IDH突变共同出现的胶质瘤定义为少突胶质瘤[1]。1p/19q杂合性缺失在低级别胶质瘤中常见，但1p/19q杂合性缺失在WHO Ⅳ级胶质瘤中很少见。1p/19q杂合性缺失是否和WHO Ⅳ级胶质瘤患者的预后相关仍有争议[17,23]，由于1p/19q杂合性缺失有假阳性的可能，主要用于胶质瘤的分类中[24]。本研究中, Ki-67蛋白表达量以及1p/19q杂合性缺失与预后不相关(P>0.05)，可能与样本量不足或判读方式的误差有关，如Fish检测的假阳性。ATRX蛋白表达，P53突变型表达也与胶质瘤预后不相关(P>0.05)，虽然它们的基因突变被证明与WHO Ⅳ级成人弥漫性胶质瘤预后相关，但其蛋白表达与预后不相关可能与其基因表达与蛋白质表达并不一致有关。

综上所述，本研究探讨了在2021年WHO中枢神经系统新分类下的WHO Ⅳ级IDH野生型GBM中，临床因素以及分子标志物蛋白表达与预后的关系。在WHO Ⅳ级IDH野生型GBM中，除了年龄、肿瘤的切除程度、术前KPS评分以及患者术后是否接受同步放化疗为评估患者预后的独立的临床因素(P<0.05)， MGMT蛋白的低表达作为分子标志物也是独立的保护因素。并且ATRX,P53, Ki-67蛋白表达以及1p/19q杂合性缺失与WHO Ⅳ级IDH野生型GBM预后不相关(P>0.05)。因此，术后可以对患者进行分子标志物的检测，除了可以更好地对患者进行临床分型，也可以对患者预后及治疗进行指导。本研究为单中心研究，样本量仍有一定局限，后续会进行临床多中心研究，以进一步探索WHO Ⅳ级IDH野生型GBM患者的预后因素以期望更好的指导临床。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。