慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP表达与心功能及预后的关系探讨

詹 洮，颜 治，吴佳莉

慢性心力衰竭是一种持续的心力衰竭状态，临床症状为呼吸困难、乏力及体液潴留等，是多种心血管疾病严重阶段或终末期的临床表现。流行病学研究显示，慢性心力衰竭发病率为1.3%～5.6%，且随着年龄增长发病率呈升高趋势[1]。心钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)又称为心钠素，主要是由心肌细胞合成、贮存及释放的，可发挥抑制血管升压素和血管紧张素的作用，具有利尿排钠、扩张血管、降低血压等功能。有研究显示，ANP水平可反映血浆容量及心房压力，可能参与慢性心力衰竭病人的病情发展[2]。微小RNA(mircoRNA，miRNA)在诱导心肌细胞增殖及再生过程中发挥着重要的作用。有研究显示，miR-199a-3p异位表达可诱导新生大鼠心肌细胞生长、增殖，其过表达可促进成年小鼠心肌细胞增殖，刺激小鼠急性心肌梗死后心肌细胞再生[3]，目前关于miR-199a在慢性心力衰竭病人中表达情况及其与预后的关系报道较少。本研究分析慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP表达水平与心室重构及病人预后的关系，以期为临床诊断慢性心力衰竭提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年3月—2019年6月于我院收治的慢性心力衰竭病人87例为研究组，所有病人均符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》[4]中慢性心力衰竭的诊断标准，其中男56例，女31例；年龄45～76(61.27±6.89)岁。入组病人均经临床病理检查或多普勒超声心动图确诊。纳入标准：心力衰竭症状持续时间>6个月；年龄<80岁；临床资料完整。排除标准：合并恶性肿瘤或血液系统疾病；合并感染性疾病；合并精神障碍、意识不清，不能配合完成检查。根据美国纽约心脏病协会(NYHA)分级标准[5]将慢性心力衰竭病人分为心功能Ⅱ级28例，Ⅲ级34例，Ⅳ级25例。同期选取与研究组年龄、性别匹配的健康体检者40名为对照组，其中男26名，女14名；年龄43～74(60.62±7.13)岁，经多普勒超声心动图检查明确心肌结构完整、心功能无异常。两组年龄、性别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集并比较所有研究对象一般资料，包括年龄、性别、身高、体重，计算体质指数(body mass index，BMI)，实验室检查指标，高血压史、糖尿病史、高脂血症史、吸烟史、饮酒史、入院时美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)评分以及血管紧张素转换酶抑制剂、免疫制剂等药物服用史等。

1.2.2 血液样本采集 抽取所有研究对象晨起空腹静脉血4 mL，以3 000 r/min离心10 min后取上清液于干净EP管中，写好编号，置于-20 ℃保存，待测。采用化学发光法检测血清ANP水平，采用酶联免疫吸附法检测血清脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)水平。试剂盒均购自上海联迈生物工程有限公司，检测方法严格按照试剂盒说明书步骤执行。

1.2.3 荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测血清miR-199a水平 首先使用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司)提取总RNA，利用紫外分光光度计(购自赛默飞公司)检测RNA浓度和纯度。利用反转录试剂盒(购自TAKARA公司)进行cDNA合成，实时荧光定量PCR试剂盒(购自TAKARA公司)进行PCR扩增，以U6为内参，由生工生物工程有限公司合成。引物序列：miR-199a正向引物5′-ACAGTAGTCTGCACATTGTTTA-3′，反向引物5′-GTGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6正向引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，反向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′。PCR反应循环条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸35 s，共40个循环。利用2-△△Ct法计算miR-199a相对表达量。

1.2.4 超声心动图检查 采用PHILIPS iU Elite彩色多普勒超声诊断仪对研究组病人进行超声心动图检查，心功能指标主要包括左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.2.5 随访 观察所有慢性心力衰竭病人入院后12个月内不良心血管事件发生情况，以发生不良心血管事件再次入院或全因死亡为终点事件，将所有病人分为发生组和未发生组。其中不良心血管事件包括纳入时未发生但在随访过程中发生或随访过程中出现的各种心脏疾病；全因死亡是指在随访过程中出现的任何原因的死亡事件。比较两组血清指标和心功能指标。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 研究组入院时NIHSS评分高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 研究组和对照组血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指标比较 与对照组比较，研究组血清miR-199a、ANP、BNP水平及LVEDD均升高(P<0.05)，LVEF降低(P<0.05)；Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP、BNP水平及LVEDD逐渐升高，LVEF逐渐降低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 研究组和对照组血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指标比较(±s)

2.3 终点事件发生组和未发生组血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指标比较 随访12个月后，发生终点事件36例，未发生51例。终点事件发生组血清miR-199a、ANP、BNP水平及LVEDD均高于未发生组(P<0.01)，LVEF低于未发生组(P<0.001)，差异有统计学意义。详见表3。

表3 终点事件发生组和未发生组血清miR-199a、ANP、BNP及心功能指标比较(±s)

2.4 慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP水平与BNP、心功能指标的相关性分析 慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP水平与BNP、LVEDD均呈正相关(P<0.05)，与LVEF均呈负相关(P<0.05)。详见表4。

表4 慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP水平与心功能指标的相关性分析

2.5 血清miR-199a、ANP、BNP水平预测慢性心力衰竭病人预后不良的临床价值 ROC分析结果显示，血清miR-199a、ANP、BNP水平预测慢性心力衰竭病人预后不良的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.802[95%CI(0.703，0.880)]，0.870[95%CI(0.781，0.933)]，0.807[95%CI(0.709，0.884)]，截断值分别为1.78，464.78 pg/mL，683.26 pg/mL，灵敏度分别为75.00%、83.33%、69.44%，特异度分别为80.39%、76.47%、89.00%。详见图1。

图1 血清miR-199a、ANP、BNP水平预测慢性心力衰竭病人预后不良的ROC曲线图

2.6 慢性心力衰竭病人预后不良的影响因素分析 以慢性心力衰竭病人是否发生终点事件为因变量(发生=1，未发生=0)，以miR-199a>1.78(是=1，否=0)、ANP水平>464.78 pg/mL(是=1，否=0)、BNP水平>683.26 pg/mL(是=1，否=0)、心功能分级(Ⅱ级或Ⅲ级=1，Ⅳ级=0)为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，miR-199a>1.78、ANP>464.78 pg/mL、BNP>683.26 pg/mL、心功能分级加重是影响慢性心力衰竭病人预后不良的独立危险因素。详见表5。

表5 慢性心力衰竭病人预后不良的影响因素分析

3 讨 论

慢性心力衰竭主要是由心肌梗死、心肌病、炎症等引起的心肌损伤，慢性心力衰竭发生时，左心室负荷加重，心功能恶化，左心室排出的动脉血不能满足身体需要，引起其他系统代偿性增加，加重心力衰竭症状[6]。因此，心力衰竭的早期诊断及治疗已成为心血管疾病临床工作的重要内容。

有研究显示，miRNAs是一类由18～22个氨基酸组成的非编码小基因片段，通过与靶基因3′-非翻译区结合，阻止信使RNA(mRNA)翻译或通过促进mRNA降解调控蛋白表达。多项研究显示，miR-199a与多种癌症如胃癌、卵巢癌等有关[7-8]。有研究显示，miR-199a是心肌细胞自噬的负调控因子[9]。本研究结果显示，慢性心力衰竭病人血清miR-199a水平高于对照组，且随心功能分级加重，miR-199a水平呈上升趋势，提示miR-199a可能参与慢性心力衰竭的发生发展过程，但具体机制尚未明确。郝丹等[10]研究显示，在自发性高血压大鼠(SHR)心肌损伤模型中，SHR组大鼠miR-199a mRNA水平高于正常对照组和miR-199a抑制剂组，左室质量(LVM)、左室质量指数(LVMI)增加，提示miR-199a可能参与高血压诱导的左心室心肌肥厚；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是miR-199a的靶基因之一，进一步转染实验发现，miR-199a可能通过负调控mTOR表达参与SHR左心室肥厚、心肌纤维化的发生发展进程。本研究结果显示，血清miR-199a与心功能指标LVEDD呈正相关，与LVEF呈负相关，终点事件发生组病人血清miR-199a水平高于未发生组，提示miR-199a可能与慢性心力衰竭病人预后有关，心肌受损越严重提示病人预后越差。

有研究显示，ANP作为心血管功能的主要调节因子，在慢性心力衰竭中发挥着重要的作用[11]。ANP主要在心房中合成分泌，可抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，舒张血管，降低血压，改善心功能[12]。慢性心力衰竭发生时，ANP分泌增加，属于机体代偿反应，可减轻心脏负荷。郭永正等[13]研究显示，心力衰竭时线粒体形态功能改变，造成大量活性氧聚集，心肌细胞正常功能受损，进一步研究显示，ANP通过上调线粒体融合相关蛋白OPA1表达，抑制线粒体分裂，从而改善后负荷引起的心肌重构及心功能不全。近年来，已有心力衰竭相关指南推荐将BNP作为评估急慢性心力衰竭病人心功能障碍的有效生物学指标[14-15]。本研究结果显示，慢性心力衰竭病人ANP、BNP水平高于对照组，提示ANP水平高表达可能与慢性心力衰竭发生有关。与未发生组比较，终点事件发生组血清ANP、BNP水平呈高表达，LVEDD升高，LVEF降低，且ANP水平与BNP、LVEDD呈正相关，与LVEF呈负相关，提示ANP水平变化与慢性心力衰竭病人不良预后有关。进一步ROC结果显示，血清miR-199a、ANP、BNP水平预测慢性心力衰竭病人预后不良的AUC分别为0.802，0.870，0.807，提示血清miR-199a、ANP、BNP对慢性心力衰竭病人预后不良有一定的预测价值。Logistic回归分析结果显示，miR-199a>1.78、ANP>464.78 pg/mL、BNP>683.26 pg/mL、心功能分级是影响慢性心力衰竭病人预后不良的独立危险因素。监测慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP、BNP水平变化可判断病情发展，对及早制定干预措施和改善病人预后具有一定的临床意义。

综上所述，慢性心力衰竭病人血清miR-199a、ANP均高于健康人群，其水平随着心功能加重呈升高趋势，且与病人不良预后有关，血清miR-199a、ANP水平升高是慢性心力衰竭病人预后不良的独立危险因素，提示miR-199a、ANP可能参与慢性心力衰竭的发生发展过程，可作为提示慢性心力衰竭病人预后不良的潜在血清学指标。慢性心力衰竭受多因素、多信号途径共同影响，今后仍需开展大样本量多中心研究对本研究结果进行验证。