昼夜节律紊乱对肠道微生态和粪便代谢组学影响的实验研究

李 青 王 博 邱弘毅 颜秀娟 程 莉 王倩倩 陈胜良

研究显示，昼夜节律紊乱（如轮班制工作、时差旅行等）与消化系统疾病（包括胃肠道功能紊乱等）密切相关[1]。流行病学资料表明，与上班时间规律的工作者比较，昼夜轮班者更易发生肠易激综合征[2-3]。另有研究表明，轮班工作者发生胃癌、结直肠癌的风险显著增高[4-6]。昼夜节律紊乱引发消化系统疾病的机制尚未明确，可能包括：（1）通过脑-肠互动紊乱引起胃肠运动、分泌等功能改变[7-9]；（2）伴随食欲和进食节律改变，从而影响胃肠道的消化、吸收功能[10-11]；（3）通过应激反应导致机体免疫炎性反应状态改变等[12-15]。以上机制可能导致肠道内微生物和营养代谢物发生变化，经脑-肠互动、体液环境改变等机制，最终影响机体的健康。目前有关昼夜节律紊乱改变肠道微生态及粪便代谢组学特征的报道较少。本研究通过建立昼夜节律紊乱小鼠模型，采用16S rRNA 测序法及靶向代谢组学分析，对比观察了昼夜节律正常组（Con 组）和昼夜节律紊乱组（JL 组）小鼠肠道菌群及粪便代谢物的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取12 只健康C57BL/6J 小鼠（雄性，6～8周龄，18～25 g，购自上海交通大学实验动物中心）作为研究对象，随机分为2 组，每组6只。以灯光模拟昼夜节律，Con 组（n＝6）于6 ∶00 a.m.打开灯光，6 ∶00 p.m.关闭灯光；JL 组（n＝5，死亡1 只）按照文献[16]所述方法进行明暗周期调整：JL 组小鼠在第1～3 天的光照时间为6 ∶00 a.m.～6 ∶00 p.m.，第 4 天光照时间段前移8 h（10 ∶00 p.m.～10 ∶00 a.m.），持续3 d 后，光照时间恢复至6 ∶00 a.m.～6 ∶00 p.m.。依此循环4 个月后，收集两组小鼠的粪便及空肠内容物，并立即置于液氮中速冷，然后于－80 ℃保存。

1.2 16S rRNA 测序

使用QIAamp 快速粪便DNA 小抽试剂盒（购自美国Qiagen 公司）提取细菌DNA，然后使用NanoDrop 2000 分光光度计（购自美国Thermo Scientific 公司）测量细菌DNA 的浓度。使用FastPfu 聚合酶及条形码引物，对DNA 样品进行PCR 扩增。使用凝胶（购自美国Axygen Biosciences公司）提取、纯化扩增子，并使用QuantiFluorTM-ST荧光计（购自美国Promega 公司）进行定量。将纯化后的扩增子以等摩尔浓度合并，使用 Illumina MiSeq 基因测序仪（购自美国Illumina 公司）进行末端配对测序。PCR 扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；之后95 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共25 个循环；最后72 ℃延伸7 min。在美吉公司的免费在线平台（www.majorbio.com）上进行 PCR 产品的高通量焦磷酸测序。

1.3 细菌分析

将16S rRNA 测序产物进行过滤、分离。在97%相似度水平下进行聚类，获得操作分类单元（OTU），然 后 使 用 Greengenes 13.8 数 据 库 对OTU 进行分类学注释。使用α 多样性指标OTU、Shannon 指数、Sobs 指数和Simpson 指数分析物种的多样性。应用QIIME 软件进行β 多样性分析，使用R 语言工具绘制主成分分析（PCA）、主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度（NMDS）分析的结果图。两组间差异的分析釆用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.4 靶向代谢组学

粪便样品的靶向代谢组学分析由麦特绘谱生物科技（上海）有限公司进行。粪便样品的制备方法如文献[17]所述。使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）系统（型号ACQUITY UPLC＋Xevo TQ-S，购自美国Waters Corp 公司）定量 11 种目标代谢物。应用MassLynx 4.1 软件（购自美国Waters 公司）分析原始数据，并对每种代谢物进行峰积分、校准和定量。应用R-Studio 软件进行统计学分析。使用PCA、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）识别两组代谢物的差异。之后，在差异代谢物中寻找具有潜在生物学意义的标志物，其特征为：VIP（Variable influence on projection）＞1 和P＜0.05（Studentt检验或 Wilcoxon 检验）。

2 结果

2.1 昼夜节律紊乱对空肠菌群的影响

16S rRNA 测序结果显示，空肠菌群产生了569 943 个原始读本。如图1 所示，韦恩图表明两组共有 913 个相同的OTU，另有216 个OTU 专属于Con 组，77 个OTU 专 属 于JL 组；Shannon 指数和Sobs 指数的稀释性曲线表明，JL 组空肠菌群的丰度较Con 组降低；α 多样性指数结果显示，与Con 组比较，JL 组空肠菌群的多样性降低，其中Shannon 指 数 下 降29.6%，Simpson 指 数 升 高167.7%，组间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。如图2 所示，PCoA 和NMDS 分析结果显示，Con组和JL 组的空肠菌群明显分为两簇；但PCA 结果未显示出明显的分群。

图 1 Con 组和JL 组小鼠空肠菌群组分、丰度和α 多样性比较 A 空肠菌群组分的韦恩图 B Sobs 指数稀释性曲线 C Shannon 指数稀释性曲线 D α 多样性指数（Shannon 指数） E α 多样性指数（Simpson 指数）

图 2 Con 组和 JL 组小鼠空肠菌群的β 多样性分析 A PCA B PCoA C NMDS 分析

物种组分分析结果显示，与Con 组比较，在门水平，JL 组空肠中Bacteroidota门细菌丰度降低，差异有统计学意义（P＜0.05），Firmicutes门细菌丰度增高，但两组差异无统计学意义；在属水平，JL组空肠中Ileibacterium属细菌丰度增高（P＜0.05），Streptococcus属、Bacteroides属、Ruminococcus_torques_group属、Faecalibacterium属细菌丰度均降低（P均＜0.05）。 见图3。

图 3 Con 组和JL 组小鼠空肠菌群差异的比较 A 门水平差异比较的柱状图 B 门水平差异的t检验分析 C 属水平差异比较的柱状图 D 属水平差异的t检验分析

2.2 昼夜节律紊乱对结肠菌群的影响

16S rRNA 测序结果显示，结肠菌群共产生了 551 482 个原始读本。如图 4 所示，韦恩图表明两组共有345 个相同的OTU，另有128 个OTU专 属 于Con 组，82 个 OTU 专 属 于JL 组；Rank-Abundance 曲线和Shannon 指数稀释性曲线均表明，JL 组结肠菌群的丰度较Con 组降低；α 多样性指数结果显示，与Con 组比较，JL 组结肠菌群的多样性降低，其中Shannon 指数下降11.9%（P＜0.05），Simpson 指数升高 65.1%，但仅有边界统计学意义。如图5 所示，根据β 多样性距离矩阵进行层级聚类分析，Con 组和JL 组的结肠菌群明显分为不同的两簇。

图 4 Con 组和JL 组小鼠结肠菌群组分、丰度和α 多样性比较 A 结肠菌群组分的韦恩图 B Rank-Abundance 稀释性曲线 C Shannon 指数稀释性曲线 D α 多样性指数（Shannon 指数） E α 多样性指数（Simpson 指数）

物种组分分析结果显示，与Con 组比较，在门水平，JL 组结肠中Bacteroidota门细菌丰度显著 降 低（P＜0.01），Firmicutes门（P＜0.05） 和Actinobacteria门（P＜0.000 1）细菌丰度均增高；在属水平，JL 组结肠中norank_f_Muribaculaceae属和Prevotellaceae_Ga6A1_group属细菌丰度均降低（P均＜0.05），Ileibacterium属、Turicibacter属、Bifidobacterium属、Enterorhabdus属（P均＜0.01）和Eubacterium fissicatena group属（P＜0.05）细 菌丰度均增高。见图6。

2.3 昼夜节律紊乱对粪便代谢物的影响

应用UPLC-MS/MS 技术分析 Con 组和JL 组的粪便代谢物。如图7 所示，与Con 组比较，JL 组粪便中氨基酸（14.11%比30.04%，P＜0.01）和吲哚（0.11%比0.20%，P＜0.01）的水平显著降低。PCA、PLS-DA 及 OPLS-DA 聚类分析结果均显示，两组的粪便代谢物呈现出明显分群。此外，与Con组比较，JL 组粪便中色氨酸（1 001.46±343.55 比2 185.52±502.33，P＜0.01）和吲哚-3-甲醛（IAId，802.04±509.31 比1 937.13±553.35，P＜0.01）的水平均显著降低；两组粪便中碳水化合物（32.45%比20.40%，P＞0.05）和 短 链 脂 肪 酸（31.95% 比29.05%，P＞0.05）的水平差异均无统计学意义。

图 5 Con 组和JL 组小鼠结肠细菌β 多样性分析 A PCA B PCoA C NMDS 分析

图6 Con 组和JL 组小鼠结肠菌群差异的比较 A 门水平差异比较的柱状图 B 门水平差异的t检验分析 C 属水平差异比较的柱状图 D 属水平差异的t检验分析

图 7 Con 组和JL 组小鼠粪便代谢物的差异分析 A PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 聚类分析 B 两组粪便代谢物差异比较柱状图 C 两组粪便代谢物中色氨酸和IAId 的水平比较

3 讨论

本研究结果表明，昼夜节律紊乱会导致肠道微生态及粪便代谢物发生变化。以往的研究主要聚焦于结肠和粪便菌群，有关昼夜节律紊乱对小肠菌群影响的报道较少。生理状态下，空肠菌群与结肠菌群并不相同，其在吸收营养物质（如碳水化合物、氨基酸、短肽、维生素等）方面发挥重要作用[18]。上消化道菌群紊乱（如小肠细菌过度生长）会导致多种消化不良症状，包括腹痛、腹泻、腹胀和吸收不良等[19]。本研究发现昼夜节律紊乱会导致空肠菌群的丰度和多样性降低，且其中Firmicutes门与Bacteroidota门的比值升高，这一比值常作为判断肠道菌群失衡的重要指标之一。有研究表明，与正常体质量者比较，肥胖动物和人的粪便中Firmicutes门与Bacteroidota门的比值较高[20]。本研究结果所示空肠菌群改变可能与未知的消化道功能学及疾病状态的机制相关联，这有待进一步的针对性研究探讨。

本研究结果显示，昼夜节律紊乱可导致结肠菌群的丰度和多样性降低，且其中Firmicutes门与Bacteroidota门的比值升高，Turicibacter属细菌丰度增高。有研究表明，Turicibacter属为促炎细菌，生酮饮食可使Turicibacter属细菌丰度降低[21]。本研究结果指出，昼夜节律紊乱增高了结肠菌群中促炎细菌的占比，这对于昼夜节律紊乱可能通过加重肠道炎性反应程度而引发消化系统疾病的机制的探索，提供了有价值的思路。

以往粪便代谢组学研究结果表明，昼夜节律紊乱主要引起氨基酸代谢失常，其中色氨酸代谢紊乱与多种代谢及免疫性疾病相关，如炎症性肠病、代谢综合征等[22]。Islam 等[23]研究发现，色氨酸对于葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型小鼠具有保护作用。另有研究表明，色氨酸的吲哚衍生物 IAId 可以保护肠黏膜的完整性并促进肠上皮增生[24]。本研究发现，JL 组小鼠中色氨酸和IAId 的水平低于Con 组，这可能是昼夜节律紊乱引发肠道炎性反应及功能紊乱的机制之一。以往有关昼夜节律改变与粪便代谢组学的关系报道较少。研究发现，生物钟基因可调控多种代谢途径，如脂质合成和脂肪酸氧化过程，从而维持机体代谢稳态[25]；同时，代谢物的利用和进食行为反过来也可以调整生物钟[26]。进一步探究昼夜节律与细胞代谢的相互调节作用，可以为针对特定代谢紊乱的临床治疗提供新的见解。

本研究存在一定不足，如所构建的昼夜节律紊乱小鼠模型不能完全模拟现代人生活方式改变的特征，因此，研究结果不能代表真实世界人类昼夜节律紊乱所引发的变化情况；其次，本研究存在样本量较小的局限性；此外，本研究未包括关于肠道菌群紊乱和粪便代谢组学改变的后续致病机制和（或）功能学研究。综上所述，本研究的结果丰富了关于昼夜节律紊乱引发肠道微生态和粪便代谢组学改变的实验数据，为今后进一步的研究储备了有益的依据。