酸碱条件对枯草芽胞杆菌FJAT—14254代谢物产生的影响①

陈峥等

摘 要 为考察酸碱条件对枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物产生的影响，采用气相色谱-质谱联用分析枯草芽胞杆菌FJAT-14254菌株的胞内成分。结果表明：通过谱库扫描得到32种高匹配率代谢物的初步鉴定结果，主要包括氨基酸类、酸类、烷烃类等，其中含量相对较高的有7种；枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物的种类和含量与其培养环境的酸碱度变化呈一定的相关性，强酸性（pH=3）条件下培养的胞内代谢物具有特异性，而接近中性（pH=5、7）条件及碱性（pH=9、11）条件下培养胞内代谢物则相似。由此推断，不同pH条件影响发酵终点的pH，进而影响枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物的产生。

关键词 气相色谱质谱联用 ；枯草芽胞杆菌 ；pH ；代谢物

分类号 S646

枯草芽胞杆菌是革兰氏阳性菌，在营养匮乏环境下，能产生具有强抗逆性的芽胞[1]。枯草芽胞杆菌在工业、农业生产中具有重要的应用。在工业中，枯草芽胞杆菌作为饲料添加剂得到一定程度的应用[2]。在农业中，枯草芽胞杆菌能分泌特异的杀虫蛋白，对防治农业病虫害具有积极的意义[3]；某些芽胞杆菌胞外代谢物还具有抑制很多植物病原微生物生长的能力，增强植物的免疫能力[4]，促进植物增产等。而这些应用与枯草芽胞杆菌的抗逆能力有关。芽孢作为休眠体对各种逆境具有很强的抵抗能力，如具有耐高温、耐挤压、耐氧化、耐酸碱等特点[5]，对枯草芽胞杆菌渡过恶劣环境具有重要意义。

枯草芽胞杆菌能产生多种功能物质，如表面活性素[6]、芬荠素（fengycin）[7]、抗生素[8]等。表面活性素具有潜在的工业应用价值，如提高石油开采率、植物病害控制等。抗生素在人类防止各种动植物真菌性病原菌中发挥重要作用，如芬荠素类抗生素对多种植物病原真菌具有较强的拮抗作用。

pH条件对枯草芽胞杆菌的应用具有很大的影响。林宝英等[9]对枯草芽胞杆菌B25的抗菌物质在酸性、中性及微碱性条件下相对稳定，而在强碱性条件下不稳定。孔建等[10]的研究结果表明，培养液的初始pH值直接影响枯草芽胞杆菌B-903菌株的生长繁殖和抗菌物质的产生与积累。蔡全信等[11]研究不同液体培养基起始pH值对球形芽胞杆菌C3-41的毒力影响，证明了pH 7下培养的发酵液毒力最强。因此，不同pH条件影响了枯草芽胞杆菌代谢物的产生和含量。

本研究选用气相色谱-质谱联用（GC-MS）对枯草芽胞杆菌FJAT-14254菌株胞内物质进行初步鉴定，通过比较不同初始pH的芽胞杆菌发酵液中的代谢物差异，探讨酸碱条件对该菌发酵液代谢物产生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：枯草芽胞杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis FJAT-14254），由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供。菌株种子培养基：胰酶大豆肉汤（TSB）培养基。菌株发酵培养基：TSB培养基。实验试剂：TSB培养基（美国BD公司），BSTFA（美国SUPELCO公司），氯仿（AR，衡阳市凯信化工试剂有限公司），甲醇（AR，衡阳市凯信化工试剂有限公司），去离子水。实验仪器：Agilent7890/5975C气相色谱/质谱联用仪（美国安捷伦公司）；JY92-2D超声波细胞粉碎机；METTLER TOLEDO电子天平AL104（梅特勒·托利多仪器有限公司）；智城恒温培养震荡器ZHWY-2102C（上海智城分析仪器有限公司）；Sartorius pH计PB-10（德国赛托利斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 发酵液的制备

用TSB培养基平板将枯草芽胞杆菌FJAT-14254菌株划线活化并培养24 h。取活化的菌株接入20 mL TSB种子培养基中，以30℃、170 r/min振荡培养12 h，成为种子液。取该种子液以1%接种量接入预先装入50 mL的TSB液体培养基中，液体培养基设置不同的酸碱梯度，pH=3、5、7、9、11。继续以30℃、170 r/min振荡培养48 h，成为枯草芽胞杆菌FJAT-14254发酵液。用pH计测定发酵后发酵液的pH值。

1.2.2 样品制备

取不同初始pH的枯草芽胞杆菌FJAT-14254发酵液置于10 mL离心管中，6 000 r/min离心10 min，倒掉上清得菌体沉淀；向离心管中加入2 mL、4℃预冷的去离子水和等体积的-20℃预冷的甲醇液，用漩涡震荡仪重新悬浮菌体；然后用超声波细胞粉碎机进行菌体细胞粉碎，向破碎后的菌液中加入2 mL、-20℃预冷的氯仿液，充分震荡混匀；在6 000 r/min条件下离心10 min，取上层甲醇水相2 mL及下层氯仿相1 mL至新的10 mL离心管中，4℃保存；取甲醇水相400 μL、氯仿相200 μL至EP管中，用氮吹仪温和的吹干；向装有样品的EP管中加入甲氧胺吡啶80 μL，37℃反应90 min；之后加入80 μL的BSTFA，混匀，70℃反应60 min；最后置于4℃冰箱中保存，等待进样。

1.2.3 色谱条件

采用HP5-MS色谱柱，进样口温度为250℃，压力为4.534 kPa，总流量为54 mL/min，隔垫吹扫流量为3 mL/min，不分流进样。升温程序为：70℃保持2 min，以10℃/min上升到140℃，保持2 min；以4℃/min上升到240℃，保持2 min；以10℃/min上升到280℃，保持8 min。

1.2.4 质谱条件

采集模式：全扫描、EMV模式、相对值。全扫描参数：开始时的质量数为50.0 amu，结束时的质量数为550.00 amu；MS温度：离子源为230℃，MS四级杆为150℃。

2 结果与分析

2.1 枯草芽胞杆菌FJAT-14254在发酵前后发酵液pH的变化

研究结果表明，初始pH对枯草芽胞杆菌FJAT-14254发酵终点pH的影响包括3种类型，类型Ⅰ：发酵初始pH为酸性，而发酵终点仍保持为酸性，如初始pH为3.00和5.00，其终点pH为3.25和6.43，保持为酸性；类型Ⅱ：发酵初始pH为中性，而发酵终点为弱碱性，如初始pH为7.00，终点pH变为7.51，呈弱碱性；类型Ⅲ：发酵初始pH为碱性，而发酵终点保持为碱性，如初始pH为9.00和11.00，终点pH为7.83和8.21，保持为碱性。

2.2 不同初始pH条件下枯草芽胞杆菌FJAT-14254高匹配胞内代谢物的分析

不同初始pH条件下枯草芽胞杆菌FJAT-14254高匹配代谢物（匹配度在80以下的代谢物不做报道）的情况见表1。在32种高匹配代谢物中，包含烷烃类16种，氨基酸5种，酸类6种，其他成分5种。

2.3 枯草芽胞杆菌FJAT-14254高含量胞内代谢物在不同初始pH条件下的变化规律

由表1可知，将相对含量高于1%的成分定义为高含量代谢物。枯草芽胞杆菌FJAT-14254高含量胞内代谢物在不同初始pH条件下的变化规律见图1-A～1-G。高含量胞内代谢物的变化规律依据波动形态可分为3种类型，（1）前峰型，是指在培养基初始pH3～11的变化过程中，此类代谢物含量最高峰大体居前，在酸性（pH=3、5）较强的条件下达到峰值；这类代谢物包括L-酪氨酸、棕榈酸、L-赖氨酸、硬脂酸。（2）中峰型，代谢物最高峰的位置大体居中，在中性（pH=7）条件下时此类代谢物达到最高值，低谷与高峰之间有一个适当的过度。这类代谢物包括十四酸、2-吡咯烷酮羧酸。（3）后峰型，代谢物最高峰的位置大体居后，在碱性（pH=9、11）较强的条件下达到峰值。这类代谢物包括二十七烷烃。

以上各种代谢物在不同pH条件下，其含量呈现一定的变化，甚至消失。由此推断不同pH条件影响发酵终点的pH，进而影响枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物的产生。

2.4 不同初始pH条件对代谢物产生的影响及不同代谢物产生的特性

2.4.1 FJAT-14254发酵液产生代谢物的聚类分析

对不同初始pH条件下的胞内代谢物进行聚类分析，结果见图2。当相关系数为25时，可将不同初始pH下的胞内代谢物分为3大类群。类群Ⅰ主要为酸类和氨基酸，包括棕榈酸、硬脂酸、琥珀酸、十四烷酸、2-吡咯烷酮羧酸、L-赖氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、尿素、肌醇、十九烷、二十八烷、二十一烷、十五烷、单硬脂酸甘油酯；类群Ⅱ主要为烷烃类，包括二十四烷、二十七烷、十二烷、二十五烷、二十二烷、乙胺、正十四烷、十七烷、萘、亚硫酸；类群Ⅲ主要为烷烃类和氨基酸，包括丁烷、十三烷、十六烷、二十烷、L-色氨酸、L-酪氨酸。

2.4.2 枯草芽胞杆菌FJAT-14254不同代谢物产生的初始pH条件的聚类分析

对不同初始pH条件下的胞内代谢物进行聚类分析，结果见图3。当相关系数为25时，可将不同初始pH下的胞内代谢物分为3大类群。类群Ⅰ包括初始pH为3的代谢物，其特点为：发酵终点pH为3.25，呈较强酸性，且含有L-色氨酸、丁烷、十三烷、二十烷，而其他类群中没有。类群Ⅱ包括初始pH为5、7的代谢物，其特点为：发酵终点pH值为6.45～7.51，呈弱酸性到弱碱性之间，只在该类群中出现的代谢物有L-赖氨酸、十九烷、二十八烷、2-吡咯烷酮羧酸、琥珀酸、十四酸、尿素、肌醇。类群Ⅲ为初始pH为9、11的代谢物，其特点为：发酵终点pH值为7.83～8.21，且含有正十四烷、二十二烷、亚硫酸、乙胺，而其他类群中没有。综上所述，初步推断酸碱度相近的发酵液中成分相对接近，而发酵液的pH在一定程度上影响了其代谢物的种类和含量。

2.5 不同初始pH条件下枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物的主成分分析

以各样品代谢标志物及相对丰度为指标，构建数据矩阵，并进行主成分分析。以不同的初始pH为变量，进行主成分分析，结果见图4。结果表明，初始pH值为5和7的样品聚为一类；初始pH值为9和11的样品聚为一类；而pH为3的样品单独聚为一类。说明初始pH3的样品中代谢物种类或含量与其他样品差别较大，仅在pH 3样品中被检测到的代谢物有L-色氨酸、丁烷、十三烷、二十烷。

3 讨论与结论

从枯草芽胞杆菌FJAT-14254胞内代谢物中分离到高匹配率物质32种，包括氨基酸、烷烃类、有机酸等，这些物质在微生物生命活动中扮演着重要作用，以下对这几类物质的活性分别进行阐述。（1）氨基酸类：色氨酸在医药、食品和饲料添加剂方面具有广泛的用途，郑蕾等[12]研究了谷氨酸棒状杆菌发酵色氨酸的工艺；丙氨酸是血液中氮的有效运输工具，还是一种重要的生糖氨基酸；异亮氨酸作为一种重要的氨基酸，白郁山等[13]研究了异亮氨酸在微生物抗酸逆境中的作用；酪氨酸作为一种重要的合成前体，其生物合成得到深入研究[14]；赵凯等[15]通过对赖氨酸合成菌株筛选得到高产菌株，对赖氨酸的应用具有促进意义。（2）有机酸类：棕榈酸和硬脂酸是生物界常见的有机酸类，一般在工业中用于物质的合成。亚硫酸因其还原性而具有一些特殊的生物活性[16]。丁二酸不仅是TCA循环中的重要物质，还是很多工业合成的原料。（3）其他物质：尿素在生物体氮代谢中扮演着重要作用，是生物体内具有重要生理作用的一类化合物。对这些高匹配物质的深入分析对于分析代谢物与芽胞杆菌抗逆之间关系具有积极意义。

枯草芽胞杆菌FJAT-14254的代谢物种类和含量与其培养环境的酸碱度变化呈一定的相关性。分析该菌胞内代谢物的聚类结果，发现较强酸性（pH=3）条件下培养的胞内代谢物具有特异性；而接近中性（pH=5、7）条件下培养胞内代谢物则相似，碱性（pH=9、11）条件下培养的胞内代谢物相似。芽胞杆菌代谢物与生长环境之间存在明显的相关性，当生长环境发生改变后，枯草芽胞杆菌FJAT-14254会及时对代谢物做出相应调整，以适应环境的变化。枯草芽胞杆菌FJAT-14254发酵终点pH朝着中性或弱碱性（pH=7.5）靠近。这是生物体与环境之间相互作用的结果，是生物体对不断变化的复杂环境的适应。初步判断，枯草芽胞杆菌FJAT-14254代谢物质随培养酸碱度的变化而做出复杂的变化，并不只是单纯的线性关系。

在枯草芽胞杆菌FJAT-14254的高含量代谢物中，二十七烷在pH 11时含量最高，酪氨酸在pH 3时含量最高。二十七烷对于菌株应对碱性环境可能具有作用，酪氨酸除作为蛋白合成必需氨基酸外，在菌株适应酸性环境中也可能发挥作用。在中性和弱酸性条件下FJAT具有更多的物质种类和更高的物质含量，初步推测在中性和弱酸性环境中菌株具有较高的代谢活力，激活代谢通路多具有更复杂的代谢网络。

此外，发酵液中与质谱谱库无匹配或者匹配率较低的成分有很多，说明该微生物主要的次生代谢成分有待深入研究。随着未知成分的深入研究，将有助于进一步揭示枯草芽胞杆菌FJAT-14254的抗逆机制。

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