miR-708 与慢性乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭患者预后的关系

吴秋萍 吴海丰 黄茂乙 周 云 周贵忠

慢加急性肝衰竭（ACLF）是指肝脏功能迅速恶化，同时伴随一个或多个器官衰竭的临床症候群，患者的短期病死率较高[1]。在中国，多数ACLF 患者在慢性乙型肝炎（CHB）的基础上发病[2]。ACLF 的发病机制较为复杂，多数患者病情严重，救治困难[3]。因此，早期诊断并了解患者的预后情况有助于提高生存率。目前虽已有多项生物标志物被报道可判断ACLF 患者的预后情况，但效能仍不能令人满意，如部分标志物的敏感度或特异度较低等[4]。miRNA 是一类由18～22 个核苷酸组成的单链非编码RNA，已被证实可参与ACLF 的发病和进展过程，如miR-223[5]、miR-125b-5p[6]、miR-130a[7]和miR-124a[8]等。miR-708 已被报道可通过调控蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路表达，抑制肝脏炎性反应[9]。此外，miR-708 还可靶向Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路，抑制肝星状细胞的活化和增殖[10]。研究表明，Akt/mTOR 信号通路和Wnt/β-catenin 信号通路均参与了ACLF 的发病和进展过程[11-12]。由此推测，miR-708 可能通过调控上述通路的表达参与CHB 相关ACLF（CHB-ACLF）的发展过程，其水平或可反映患者的预后情况。目前，关于miR-708是否参与了ACLF 的发生、发展过程方面鲜有报道。本文探究了miR-708 与CHB-ACLF 患者预后生存情况的关系，以期寻找效能较高的指标用以判断患者的预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2018 年3 月至2020 年6 月在海南医学院第二附属医院就诊的128 例CHB-ACLF 患者（设为CHB-ACLF 组）和100 例CHB 患者（设为CHB 组）作为研究对象。参照《慢性乙型肝炎防治指南（2015 更新版）》[13]诊断CHB，参照《肝衰竭诊治指南（2012 年版）》[14]诊断ACLF。纳入标准：（1）确诊为CHB-ACLF 或CHB；（2）表现为凝血功能障碍[国际标准化比值（INR）＞1.5]、黄疸[总胆红素（TBiL）＞85 μmol/L）]和低蛋白血症；（3）近1 个月内有腹水或并发肝性脑病。排除标准：（1）伴有严重的细菌感染或病毒感染；（2）伴有自身免疫性疾病，如炎症性肠病、自身免疫性肝炎等；（3）伴有恶性肿瘤；（4）随访失联。CHB-ACLF 组的年龄为31～67 岁，平均年龄为（48.52±7.86）岁；其中男性78 例，女性50 例。CHB 组的年龄为33～68 岁，平均年龄为（47.99±6.53）岁；其中男性65 例，女性35 例。两组在年龄（t＝0.547，P＝0.585）和性别（χ2＝0.396，P＝0.529）方面的差异均无统计学意义，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准（批件号YL018003），纳入的受试者均签署了知情同意书。

1.2 临床资料

收集所有受试者的年龄、性别、TBiL、INR、肌酐、终末期肝病模型（MELD）评分、血小板计数（PLT）和白细胞计数（WBC）等临床资料。使用全自动生物化学分析仪检测TBiL 和肌酐水平，使用Sysmex XN-3000 型全自动血细胞分析仪检测PLT 和WBC，使用ACL-TOP 型全自动凝血分析仪检测INR。于CHB-ACLF 患者入院1 周后开始随访，采用电话随访或住院观察的方式了解患者90 d 的生存情况，末次随访时间为2020 年9 月28 日，将随访过程中患者死亡定义为终点事件。

1.3 miR-708 水平检测

采用实时荧光定量PCR 法检测各组患者血清miR-708 的表达水平[15]。所有患者于入院24 h 内抽取肘部静脉血10 mL，离心后获取上层清液，置于-80 ℃环境中保存，待测。采用TRIzol 法提取血清中总RNA，使用反转录试剂盒（购自日本TaKaRa公司）将RNA 反转录为cDNA，并使用PCR 仪（购自美国Bio-Rad 公司）扩增cDNA，扩增条件为95 ℃预变性5 min，之后95 ℃ 30 s、59 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，共40 个循环。以U6 作为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-708 的相对表达量。引物由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，引物序列详见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

应用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用多因素logistic 回归模型分析影响CHB-ACLF 患者预后的危险因素。采用ROC 曲线评价miR-708 判断CHB-ACLF 患者预后的效能。采用限制性立方样条拟合logistic 回归模型分析miR-708 与CHB-ACLF 患者预后的关系。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清miR-708 水平比较

CHB-ACLF 组的血清miR-708 相对表达量为0.43±0.16， 低 于CHB 组（0.75±0.14）， 两 组 的差异有统计学意义（t＝16.422，P＜0.001）。CHBACLF 组入院后90 d 的生存率为51.56%（66/128）。根据CHB-ACLF 患者的预后生存情况将其分为生存组（n＝66）和死亡组（n＝62）。生存组的血清miR-708 相对表达量为0.52±0.14，高于死亡组（0.33±0.11），两组的差异有统计学意义（t＝8.713，P＜0.001）。

2.2 生存组和死亡组的基本资料比较

生存组和死亡组在年龄、性别方面比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）。生存组的PLT 水平高于死亡组，而TBiL、INR、肌酐、WBC 和MELD评分均低于死亡组，两组的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 生存组和死亡组的基本资料比较

2.3 影响CHB-ACLF 患者预后的危险因素

将CHB-ACLF 组入院90 d 的生存情况作为因变量，将PLT、TBiL、INR、肌酐、WBC、MELD评分和miR-708 作为自变量（均为原始值录入），纳入多因素logistic 回归分析，结果显示INR、肌酐和MELD 评分是CHB-ACLF 患者预后的独立危险因素（P＜0.05），miR-708 是CHB-ACLF 患者预后的独立保护因素（P＜0.05）。见表3。

表3 CHB-ACLF 组预后的logistic 回归分析

2.4 miR-708 与CHB-ACLF 患者预后生存的关系

miR-708 判断CHB-ACLF 患者预后生存的ROC曲线下面积（AUC）、最佳截断值、敏感度和特异度分 别 为0.864（95%CI：0.802～0.926）、0.39、79.03%和80.30%。MELD 评分判断CHB-ACLF 患者预后生存的AUC、最佳截断值、敏感度和特异度分别为0.775（95%CI：0.693～0.857）、27 分、62.90% 和84.85%。结果表明miR-708 判断CHB-ACLF 患者预后生存的AUC 大于MELD 评分，但两者的差异无统计学意义（Z＝1.680，P＝0.093），见图1A。采用限制性立方样条拟合多因素logistic 回归模型分析miR-708 与CHB-ACLF 患者预后生存的关系，结果显示当节点个数为3 时，AIC 值最小（AIC＝122.218），这提示miR-708 与CHB-ACLF 患者的预后生存有关（χ2＝32.20，P＜0.001），且呈线性关系（非 线 性 检 验χ2＝1.07，P＝0.300）。以miR-708 判断CHB-ACLF 患者预后生存的最佳截断值作为分界点，当miR-708＜0.39 时，CHB-ACLF 患者预后发生死亡的风险升高；当miR-708＞0.39 时，CHBACLF 患者预后发生死亡的风险降低，见图1B。

图1 miR-708 与CHB-ACLF 患者预后生存的关系 A miR-708 和MELD 评分判断CHB-ACLF 患者预后生存的ROC曲线 B miR-708 与CHB-ACLF 患者预后生存的限制性立方样条图

3 讨论

目前已被应用于ACLF 预后评估的生物标志物主要包括与免疫反应、炎性反应、氧化应激相关的标志物，以及基因组学标志物等，但由于ACLF的诱因、发病机制、临床干预措施等的多样性及个体化差异，各项标志物仍存在一定的局限性[16]。因此，探寻能够准确判断ACLF 患者预后情况的生物标志物具有重要意义。

本研究结果显示，CHB-ACLF 组的血清miR-708 相对表达量低于CHB 组，这提示miR-708 可能参与了CHB 进展为ACLF 的过程。本研究结果还显示，CHB-ACLF 患者中生存组的血清miR-708 相对表达量高于死亡组，这提示miR-708 可能参与了ACLF 的发展过程，其水平或可反映患者的预后情况。为避免混杂因素影响分析结果，本研究将可能与CHB-ACLF 患者预后生存相关的因素纳入多因素logistic 回归模型，分析结果显示miR-708 是CHB-ACLF 患者预后的独立保护因素。有研究表明，miR-708 不仅可靶向Akt/mTOR 信号通路抑制肝脏炎性反应，还可靶向Wnt/β-catenin 信号通路抑制肝星状细胞的活化和增殖[9-10]。此外，Akt/mTOR 信号通路与人肝星状细胞内炎性因子的表达有关[11]，Wnt/β-catenin 信号通路的药理学刺激可抑制硫代乙酰胺诱导的急性肝衰竭进程[12]。由此推测，miR-708 的表达水平与肝脏炎性反应和纤维化程度密切相关，可反映CHB-ACLF 患者的预后情况。此外，本研究结果还显示INR、肌酐和MELD 评分是CHB-ACLF 患者预后的独立危险因素，这与已报道的研究结论相符[17-18]。

本研究构建了miR-708 判断CHB-ACLF 患者预后生存的ROC 曲线，结果显示miR-708 判断CHB-ACLF 患者预后生存的AUC、敏感度和特异度分别为0.864、79.03%和80.30%，其诊断效能优于MELD 评分，可辅助用于CHB-ACLF 的预后判断。此外，限制性立方样条拟合多因素logistic 回归分析结果显示，miR-708 与CHB-ACLF 患者的预后呈线性关系，且低水平的miR-708 提示CHB-ACLF 患者预后发生死亡的风险增高。

综上所述，检测CHB-ACLF 患者血清miR-708的表达水平有助于判断患者的预后生存情况。本研究尚存在不足之处，比如为单中心研究，纳入的样本量有限，尚不能完全排除地域、个体化差异等因素对分析结果的影响；且本研究未开展基础实验分析miR-708 是否可通过靶向Akt/mTOR 和Wnt/β-catenin 信号通路参与CHB-ACLF 的进展过程。今后课题组将针对以上不足之处，进一步探究miR-708 影响CHB-ACLF 患者预后的病理、生理学机制。